气相色谱法测定恩曲他滨中5 种有机溶剂残留量

时间：2024-05-22

王春霞，徐艳梅，盖成，苗会娟，毕华，高燕霞

(河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050200)

恩曲他滨属于新型核苷类逆转录酶抑制剂，是近年来开发的疗效较好的治疗艾滋病的药物，对HIV-1、HIV-2、HBV 均具有抗病毒活性[1-4]。该原料药的制备过程中使用了甲醇、乙醇、正己烷、四氢呋喃和苯等有机溶剂，为了控制该产品的质量，应对残留溶剂进行测定。韩学静等采用顶空进样方法同时测定上述5 种残留溶剂的含量[5]，用水作溶剂，采用盐析的方法，增强难溶于水的组分的响应值。盐析效应由于其耐热性、耐溶剂能力有限，故适用范围受限。随着气相色谱发展技术的进步，近年来残留溶剂的测定一般不采用盐析的方法，对于难溶于水的组分，采用一定浓度的有机溶剂溶解，即解决了溶解分散性问题，又可增强检测器上的响应值。笔者分别采用顶空进样[6-9]气相色谱法测定恩曲他滨中甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯和直接进样[10]气相色谱法测定恩曲他滨中的正己烷，既避开了盐析方法的缺点，又完美地解决了正己烷在高温下与恩曲他滨中间体生成聚合物导致回收率较低的问题，该方法简便、灵敏、数据准确，可用于恩曲他滨原料药中残留溶剂的测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：7890B 型，美国安捷伦科技有限公司。

顶空进样器：7600 型，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：XS105 型，感量为0.01 mg，瑞士-梅特勒-托利多公司。

恩曲他滨原料药：批号分别为200512、200513、200514、200605，某药厂提供。

甲醇、乙醇、正己烷、四氢呋喃、苯对照品：纯度分别为99.8%、99.9%、99.8%、99.9%、99.9%，天津市光复精细化工研究所。

N，N-二甲基甲酰胺(DMF)：色谱纯，美国Honeywell 公司。

实验用水为纯化水。

1.2 溶液制备

恩曲他滨样品溶液：(A)精密称取恩曲他滨原料药0.2 g，置于20 mL 的顶空瓶中，精密加入2 mL 10% DMF 溶液溶解，密封；(B)精密称取恩曲他滨原料药约2 g，置于10 mL 容量瓶中，用DMF 溶解并稀释至标线，摇匀。

甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯混合对照品储备溶液：精密量取苯22.8 µL，置于100 mL 的容量瓶中，用DMF 稀释至标线，摇匀；精密量取上述溶液1 mL，置于100 mL 的容量瓶中，加入DMF 9 mL，精密加入甲醇378 µL、乙醇633 µL、四氢呋喃81 µL，用水稀释至标线，摇匀，配制成甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯的质量浓度分别为3.0、5.0、0.72、0.002 mg/mL的混合对照品储备溶液。

甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯混合对照品溶液：精密量取4 种混合对照品储备溶液5 mL，置于50 mL的量瓶中，用体积分数为10%的DMF 稀释至标线，摇匀，配制成甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯的质量浓度分别为0.3、0.5、0.72、0.000 2 mg/mL的混合对照品溶液，摇匀。

甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯系列混合标准工作溶液：精密量取甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯混合对照品储备液20、25、10、5、2、2 mL，分别置于50、100、50、50、25、50 mL 容量瓶中，用10%的DMF 溶液稀释至标线，摇匀，配制成甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯系列标准工作溶液。各组分系列标准工作溶液的浓度见表1。

正己烷对照品溶液：精密量取正己烷44.3 µL，置于100 mL 容量瓶中，用DMF 稀释至标线，摇匀，配制成正己烷质量浓度为0.29 mg/mL 的对照品储备液；精密量取5 mL 对照品储备液，置于50 mL 容量瓶中，用DMF 稀释至标线，摇匀，配制成正己烷质量浓度为0.029 mg/mL 的对照品溶液。

甲醇、乙醇、四氢呋喃、正己烷、苯混合对照品溶液：精密量取甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯混合对照品储备液5 mL 和正己烷对照品储备液5 mL，置于50 mL 量瓶中，加10% DMF 溶液稀释至标线，摇匀。

正己烷系列标准工作溶液：精密量取正己烷对照品溶液20、25、10、5、3、2 mL，分别置于50、100、50、50、50、50 mL 容量瓶中，用DMF 稀释至标线，摇匀，配制成正己烷系列标准工作溶液。系列标准工作溶液的质量浓度见表1。

表1 5 种组分的系列标准工作溶液

1.3 色谱条件

色谱柱：DB-1 毛细管柱(50 m×0.53 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：程序升温，起始温度为40 ℃，保持4 min，以5 ℃/min 的速率升至180 ℃，保持1 min；载气：氮气，流量为4.0 mL/min，恒流；进样口温度：200 ℃；检测器温度：250 ℃；进样方式：分流进样，分流比为10∶1；进样体积：1.0 mL(顶空进样)，1.0 μL(直接进样)。

1.4 实验方法

1.4.1 顶空进样色谱法测定甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯

精密量取甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯混合对照品溶液和恩曲他滨样品溶液各2 mL，置于20 mL 顶空瓶中，顶空平衡温度为80 ℃，顶空平衡时间为30 min，分别精密量取顶空瓶上部气体1 mL 注入气相色谱仪，按1.3 色谱条件测定，以色谱峰面积外标法定量。

1.4.2 直接进样色谱法测定正己烷

精密量取正己烷对照品溶液和恩曲他滨样品溶液各1 µL，注入气相色谱仪，按1.3 色谱条件测定，以色谱峰面积外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择及色谱条件

选用强极性HP-INNOWax 毛细管柱进行试验，结果表明乙醇与苯分离欠佳；选用DB-1 毛细管柱(50 m×0.53 mm，5 μm)，可使甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯和正己烷5 种残留溶剂有效分离，避免了溶剂的干扰，采用程序升温提高了分离效率，缩短了分析时间。

2.2 进样方式的选择

顶空进样技术可以避免繁琐的样品处理过程，避免有机溶剂对分析造成的干扰，减少对色谱柱及进样口的污染，可有效提高苯的响应值。由于苯的ICH (国际人用药品注册技术协调会)规定限度[11-14]很小，在直接进样色谱系统中，其色谱峰响应值较小，故采用顶空进样法测定。实验数据表明，顶空温度为80 ℃，平衡时间为30 min 时，顶空瓶中气液两态达到最大饱和状态，故选择顶空平衡温度为80℃，平衡时间为30 min。

曾尝试在顶空气相色谱系统中同时测定甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯和正己烷5 种残留溶剂的残留量，试验发现正己烷的回收率特别低，平均回收率为23.6%。查阅生产工艺流程发现，其原因是正己烷与恩曲他滨某个中间体在顶空预热过程中发生聚合反应。为了解决正己烷回收率低问题，用直接进样法测定正己烷，且直接进样法色谱条件与顶空色谱系统一致，采用N，N-二甲基甲酰胺为溶解介质，回收率为90.4%，结果满意。

2.3 溶解介质的选择

由于正己烷和苯难溶于水，不能在水中完全均匀分散；而用DMF 作溶解介质时，苯与DMF 完全互溶，其分子间结合力较强，顶空加热过程中苯难以溢出，故苯的色谱峰响应值非常低[15-20]。为兼顾溶解性和灵敏度，试验中曾考察了5% DMF、10%DMF、15% DMF、20% DMF、25% DMF、50% DMF六种溶液作溶解介质，结果表明：10% DMF 溶液作为溶解介质最佳，苯的响应值较大，因此选择10%DMF 作为溶解介质。

2.4 稳定性试验

取恩曲他滨样品6 份，按照1.2 方法制备恩曲他滨样品溶液，分别在0、1、2、4、6、8 h 进样测定，计算各组分色谱峰面积，结果列于表2。由表2 可知，甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯、正己烷5 种溶剂色谱峰面积测定值的相对偏差分别为0.2%、0.1%、0.2%、2.8%、1.3%，表明样品溶液稳定性良好。

表2 稳定性试验数据

2.5 色谱图

(1)取10% DMF 溶剂空白溶液和甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯、正己烷混合对照品溶液，用顶空法分别进样测定，色谱图分别如图1、图2 所示。

图1 10% DMF 溶剂空白溶液色谱图

图2 甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯混合对照品溶液色谱图

由图1、图2 可知，溶剂(N，N-二甲基甲酰胺)对主要成分的测定无干扰，且4 种有机溶剂成分之间分离良好，色谱峰形状尖锐、对称，易于定量。

(2)取正己烷对照品溶液、恩曲他滨加标样品溶液和10% DMF 溶剂空白溶液，直接进样测定，色谱图分别如图3～图5 所示。由图3～图5 可知，溶剂DMF 及其它4 种成分对正己烷的测定无干扰，且正己烷色谱峰形状尖锐、对称，易于定量。

图3 正己烷对照品溶液色谱图

图4 恩曲他滨样品加标溶液

图5 10%DMF 溶剂空白溶液色谱图

2.6 线性关系与检出限

(1)分别精密量取1.2 中配制的甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯系列标准工作溶液2 mL，置于20 mL 顶空瓶中，在1.3 色谱条件下测定，以甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯的质量浓度为横坐标、对应的色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，计算得线性方程、相关系数见表3。

表3 甲醇、乙醇、四氢呋喃、苯4 种组分的线性关系

(2)在1.3 色谱条件下测定1.2 中配制的正己烷系列标准工作溶液，以正己烷的质量浓度为横坐标、对应的色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，计算得线性方程为Y=6.631 2X+3.456 5、线性范围为0.011 59～0.115 9 mg/mL，相关系数为0.999 9。

2.7 定量限与检出限

取空白加标样品溶液，逐步稀释并测定，以信噪比为3 对应的质量浓度作为检出限，以信噪比为10 对应的质量浓度作为定量限。甲醇、乙醇、四氢呋喃和苯的检出限分别为0.6、1.0、1.4、0.4 ng/mL；定量限分别为1.9、3.1、4.3、1.3 ng/mL。正己烷的检出限为8.7 ng/mL，定量限为26.2 ng/mL。