高效液相色谱法测定杜仲壮骨丸中马兜铃酸A

时间：2024-05-22

庞逸辉，李岳，张宪

(北京市药品检验所，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206)

杜仲壮骨丸是采用贵州省道地药材杜仲等作为主要原料所研制的中药复方制剂，该制剂由杜仲、人参、细辛、淫羊藿、黄芪、豹骨，寻骨风等24 味药材组成，具有益气健脾，养肝壮腰，活血通络，强筋健骨，祛风除湿的功效[1-2]。临床上用于治疗风湿痹痛，筋骨无力，屈伸不利，步履艰难，腰膝疼痛，畏寒喜温等症[3]。但该制剂成分中含有寻骨风、细辛这两味药材，尤其是寻骨风已经研究表明其中含有毒性成分马兜铃酸A[4-5]，而细辛则根据其不同来源被认为可能含微量的马兜铃酸A[6-7]。虽然目前未有直接的证据表明马兜铃酸能够诱导肝癌的发生，但部分研究已证实：马兜铃酸存在着明显的肾毒性，可以对肾小管功能造成损害，甚至存在诱导肾癌发生的风险[8-9]。为保障及提高患者的用药安全，自2008 年起，国家食品药品监督管理局对含有马兜铃酸的药材及制剂进行更为严格的监督管理[10]。2017 年10 月30 日，国家食品药品监督管理总局官方网站公布了《含马兜铃属药材的已上市中成药品种名单》、《可能含有马兜铃酸的马兜铃科药材名单》，杜仲壮骨丸被收录入《含马兜铃属药材的已上市中成药品种名单》中。

谌晶晶等[11]发现，马兜铃酸对斑马鱼有一定的肾毒性和耳毒性。朱哿瑞等[12]研究发现马兜铃酸Ⅰ能致使小鼠发生急性肝毒性损伤。谢大英等[13]研究发现，马兜铃酸A 有一定的致突变性。于巧红等[14]研究发现，市售的17 种中成药均符合生物药剂分类学Ⅲ类药物的特点，在含有马兜铃酸A 的制剂中马兜铃酸A 具有体内体外一致性，有申请生物豁免的潜力。为更好的保证市面上所销售的杜仲壮骨丸的用药安全，应对该中药复方制剂所含有的毒性成分马兜铃酸A 进行严格的限量控制。邱泉等[15]用高效液相色谱(HPLC)法测量神农蛇药酒中马兜铃酸A 的含量，该方法准确，简便，重现性好，灵敏度高。目前尚未发现采用HPLC 法对杜仲壮骨丸中马兜铃酸A 含量测定的研究报道。

笔者经探索建立了高效液相色谱法测定杜仲壮骨丸中马兜铃酸A 的含量，该方法操作简单、所使用试剂价廉易得，测定结果准确可靠，可用于杜仲壮骨丸中马兜铃酸A 的限量检查。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-20A 型，岛津企业管理(中国)有限公司。

工作站：LCsolution，岛津企业管理(中国)有限公司。

紫外检测器：SPD-20A 型，岛津企业管理(中国)有限公司。

电子天平：MS104S 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

数控超声波清洗器：KQ-500DB 型，昆山市超声仪器有限公司。

马兜铃酸A 对照品：批号为112054-201902，质量分数为99.0%，上海雅吉生物科技有限公司。

甲醇：色谱纯，美国天地有限公司。

杜仲壮骨丸样品：贵阳德昌祥药业有限公司。

实验用其余试剂均为分析纯。

实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；柱温：35 ℃；流动相：甲醇-水(体积比为4∶1)溶液，流量为1.0 mL/min；检测波长：315 nm；进样体积：10 μL。

1.3 溶液配制

马兜铃酸A 对照品溶液：0.15 μg/mL，精密称取于五氧化二磷干燥器中减压干燥至恒重的马兜铃酸A 对照品适量，加入流动相，混匀。

马兜铃酸A 系列标准工作溶液：精密吸取马兜铃酸A 对照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL，分别置于6 只10 mL 容量瓶中，加入流动相稀释至标线，摇匀，配制成马兜铃酸A 的质量浓度分别为0.007 5、0.015、0.03、0.075、0.12、0.15 μg/mL的系列标准工作溶液。

1.4 样品处理

取50 粒杜仲壮骨丸样品，碾细，精密称取样品粉末1.0 g 至具塞锥形瓶中，精密加入40 mL 甲醇溶液，称重并记录，超声40 min (功率为500 W，频率为40 kHz)，冷却后再次称重，用甲醇溶液补足损失的重量，摇匀，用0.22 μm 过滤膜过滤，待测。

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件选择

2.1.1 提取溶剂

分别选用乙醇、50%乙醇溶液、甲醇、50%甲醇溶液4 种溶剂对杜仲壮骨丸样品中的马兜铃酸A进行提取，结果表明，以甲醇为提取溶剂时，色谱基线平稳、马兜铃酸A 色谱峰峰形较好，色谱峰面积较大，因此选择甲醇为提取溶剂。

2.1.2 提取方法

以甲醇作为提取溶剂，分别采用连续回流提取法及超声提取法对杜仲壮骨丸样品中的马兜铃酸A进行提取，结果表明，两种提取方法测定的色谱峰峰形相近，色谱峰面积大小几乎一致，考虑到超声提取法操作更为便捷，因此选定超声提取法。

2.1.3 提取时间

考察超声提取时间分别为20、30、60 min 时杜仲壮骨丸样品中马兜铃酸A 的提取效果，结果表明，当超声时间达到30 min 后，提取液中马兜铃酸A 的色谱峰面积趋于稳定，表明目标物质马兜铃酸A 的提取较完全，为保证马兜铃酸A 提取完全，选择将超声时间适当延长至40 min。

2.2 检测波长选择

采用紫外检测器于250～400 nm 波长范围内扫描对照品溶液，获得马兜铃酸A 在全扫描波长的紫外吸收光谱图如图1 所示。由图1 可以看出，马兜铃酸A 在315 nm 处有最大吸收，因此选择马兜铃酸A 的检测波长为315 nm。

图1 马兜铃酸A 在250～400 nm 波长范围内紫外吸收光谱图

2.3 色谱条件优化

分别考察甲醇-水溶液和乙腈-水溶液两种流动相体系对马兜铃酸A 的分离效果，结果发现，当流动相为甲醇-水(体积比4∶1)溶液时，色谱基线平稳、色谱峰的分离效果更好，故选择甲醇-水(体积比4∶1)溶液为流动相。

以甲醇-水(体积比4∶1)溶液为流动相，分别考察流量为0.8、1.0，1.2 mL/min 时马兜铃酸A的分离效果，结果发现，当流动相流量为1.0 mL/min 时，马兜铃酸A 的色谱峰峰形对称，且分离效果最好，故选择流动相流量为1.0 mL/min。

以甲醇-水(体积比4∶1)溶液为流动相，相流量为1.0 mL/min。分别考察柱温为25、30、35、40 ℃时马兜铃酸A 的分离效果，结果发现，当色谱柱温度为35 ℃时，色谱峰的分离效果最好，故选择柱温为35 ℃。

2.4 对照品与样品色谱图

在1.2 色谱条件下，对马兜铃酸A 对照品溶液和样品溶液进行测定，结果如图2 和图3 所示。对照图2 和图3 可知，在样品溶液色谱图中，马兜铃酸A 色谱峰与其它色谱峰分离良好，适于定量。

图2 对照品溶液色谱图

图3 样品溶液色谱图

2.5 线性方程与检出限

按照1.2 色谱条件，自动进样器依次吸取10µL马兜铃酸A 系列标准工作溶液，注入高效液相色谱仪，测定色谱峰面积。以马兜铃酸A 的质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，计算线性方程得y=837.224x+12.416 3，相关系数为0.999 8，线性范围为0.007 5～0.150 μg/mL。将对照品溶液用甲醇逐级稀释，在1.2 色谱条件下进样测定，以3 倍信噪比对应的质量浓度作为方法检出限，该方法检出限为0.001 μg/mL。

2.6 精密度试验

取杜仲壮骨丸样品，按照1.4 方法平行制备6份样品溶液，在1.2 色谱条件下分别进样测定，结果见表1。由表1 可知，测定结果的相对标准偏差为0.96%，表明该方法精密度良好。

表1 精密度试验马兜铃酸A 质量分数测定结果 %

2.7 加标回收试验

精密称取已测定含量的杜仲壮骨丸样品6 份，每份约0.1 g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入马兜铃酸A 对照品1 mL，然后按1.4 方法制备样品溶液。在1.2 色谱条件下分别进样测定，计算马兜铃酸A 的加标回收率，结果见表2。由表2 可知，马兜铃酸A 平均回收率为99.27%，表明该方法具有较高的准确度。

表2 加标回收试验结果(n=6)