超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱法分析莱菔子化学成分

冯俊杰，蒋海强，董梅月，蒋安琪，王小明

（山东中医药大学药学院，济南 250355）

萝卜（Raphanus sativus L.）属十字花科植物，它的多个部位都具有药用价值［1］，但是只有其干燥成熟的种子被列入中华人民共和国药典［2］，名为莱菔子（Semen Raphani）。莱菔子常用于消食、消肿、降气、化痰，临床上与常其它中药结合用于治疗食物消化不良、上腹部胀痛、便秘、腹泻痢疾、气喘、咳嗽痰瘀等［1-3］。研究表明，莱菔子中含有的不同种类化学成分是莱菔子发挥中药活性的药效物质基础。莱菔子炒制品多为药用，“杀酶保苷”使其含有丰富的硫苷类化合物和芥子酸苷类化合物［4］。莱菔子的主要特征性化学成分为天然硫代葡萄糖苷（简称硫苷，又名芥子油苷），此外还含有生物碱类、挥发油和脂肪酸类、黄酮类、多糖、酚酸类和蛋白质类［5］。硫苷属于十字花科植物的一种含硫次生代谢产物，是饮食中抗癌化合物的前体，可以在酶催化、热反应或者化学反应等途径下产生降解产物异硫代氰酸盐、硫代氰酸盐、腈类化合物或异硫氰酸酯等［6-8］。芥子碱作为莱菔子生物碱类最主要的成分，以芥子碱硫氰酸盐的形式存在，是一种广泛存在于十字花科植物中的季胺型生物碱，具有广泛的药理作用［9-10］。钩藤总生物碱和莱菔子可溶性生物碱可以联合应用于N’-硝基-L-精氨酸诱导的高血压大鼠的治疗，具有良好的降压作用和内皮保护作用［11］。

液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术已广泛应用于定性分析、靶向定量分析和质量控制，可以通过分离化合物、检测并捕获其结构信息实现复杂中药成分原型及代谢物的鉴定［12-14］。超高效液相色谱（UPLC）具有快速分离化合物的能力，高分辨质谱（HRMS）具有选择性好、灵敏度高、质量精确度好、专属检测能力强等特点，UPLC-HRMS联合使用［15-17］，可产生用于辅助结构推测的二级质谱信息（包括前体离子和碎片离子）。在UPLC-Q-Orbitrap-MS中，四极杆对母离子具有高选择性，轨道离子阱（Orbitrap）对精确质量数具有高分辨性，样品的基质效应小，可以实现复杂中药或生物样品成分的定性和定量分析［17-18］。笔者应用UPLC-Q-Orbitrap-MS技术对莱菔子的化学成分进行分析，采用数据挖掘策略系统鉴定，初步鉴定出包括硫苷类、阿魏酰类、芥子酰类、黄酮类等多个类别在内的70个化学成分。该实验的研究结果为阐明莱菔子的化学成分提供了科学依据，从而为莱菔子的深入研究和进一步开发利用奠定药效物质基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱系统-质谱联用仪：Thermo Fisher Ultimate 3000型及Q Exactive型，美国赛默飞世尔科技公司。

质谱工作站：Xcalibur 3.0型，美国赛默飞世尔科技公司。

电子分析天平：CP225D型，感量为0.01 mg，德国赛多利斯公司。

超声清洗器：KQ-250E型，昆山市超声仪器有限公司。

漩涡混匀器：MX-S型，美国赛洛捷克公司。

恒温混匀仪：MSC-100型，杭州奥盛仪器有限公司。

台式离心机：Heraeus Biofuge Primo R型，美国赛默飞世尔科技公司。

粉碎机：DFY-1000C型，温岭市林大机械有限公司。

旋转蒸发器：300型，瑞士布奇公司。

莱菔子：批号为No.181020，经山东中医药大学周洪雷教授鉴定为萝卜的干燥成熟种子，标本存放于山东中医药大学药学院，编号为2018LFZ01。

甲醇、甲酸、乙腈：色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司。

无水乙醇：吉林省新天龙实业股份有限公司。

石油醚：上海沪试化工有限公司。

实验用水：蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。

芥子碱标准品：经HPLC面积归一化法测定纯度大于98%，成都克洛玛生物科技有限公司。

3-丁烯基硫代葡萄糖苷、2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、3-（甲基亚磺酰基）丙基硫代葡萄糖苷、莱菔苷、2-苯乙基硫代葡萄糖苷、金莲葡萄糖硫苷、吲哚甲基硫代葡萄糖苷、4-甲基硫代丁基硫代葡萄糖苷、1-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、芥子酸甲酯、芥子酸、E-芥子酸龙胆二糖苷标准品：经HPLC面积归一化法测定，纯度均大于98%，德国PhytoLab公司。

1.2 溶液配制

标准品溶液：分别精密称取标准品芥子碱、3-丁烯基硫代葡萄糖苷、2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、3-（甲基亚磺酰基）丙基硫代葡萄糖苷、莱菔苷、2-苯乙基硫代葡萄糖苷、金莲葡萄糖硫苷、吲哚甲基硫代葡萄糖苷、4-甲基硫代丁基硫代葡萄糖苷、1-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、芥子酸甲酯、芥子酸、E-芥子酸龙胆二糖苷适量，用70%甲醇溶解，配制成质量浓度均为0.50 mg／mL的标准品贮备液。精密吸取各标准品溶液20 μL得到混合标准品溶液（0.04 mg／mL），以 12 000 r／min离心 10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜后4 ℃备用。

样品溶液：称取500 g莱菔子适当粉碎，加入1 500 mL石油醚，脱脂3次，以2 000 mL的70%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，过滤后合并提取液，减压回收乙醇至提取物呈浸膏状，浓缩，水浴蒸干，真空冷冻干燥后得到冻干状提取物，计算得率为12.30%。精密称取莱菔子提取物0.1 g，以70%甲醇-水超声溶解，涡旋、振荡并以12 000 r／min离心10 min，配制成提取物质量浓度为20 mg／mL的样品溶液，用于UPLC-Q-Orbitrap-MS分析。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱条件

色 谱 柱：ACQUITY UPLC®HSS T3色 谱 柱［100 mm×2.1 mm，1.8 μm，沃特世科技（上海）有限公司］；柱温：40 ℃；流量：0.3 mL／min；流动相：0.05%甲酸溶液（A）-0.05%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱：0～3 min为 0%B，3～8 min为 0～5%B，8～10 min为5%B，10～15 min为5%～15%B，15～17 min为 15%B，17～24 min为 15%～30%B，24～28 min为30%～70%B，28%～30 min为70%～100%B，30～35 min为100%B，35～35.1 min为100%～0%B，35.1～40 min为 0%B ；进样体积：3 μL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）：正、负离子模式；鞘气：13.5 L／min；辅助气流量：3 L／min；喷雾电压：3 kV；毛细管温度：350 ℃；辅助气温度：350 ℃；碰撞 能 量：20、40、60 eV；检 测 方 式：Full MS／dd-MS2（Full MS分辨率为70 000，dd-MS2分辨率为17 500）；质量扫描范围：m/z 80～1 200；S-Lens RF Level：55。

1.4 成分分析与鉴定

采用UPLC-Q-Orbitrap-MS分别在正、负离子模式下检测、采集数据，得到总离子流图。首先，检索TCMSP （https://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库，并在Pubmed及CNKI查阅相关的国内外文献，整理莱菔子及其种属的已知化学成分，然后将化合物导入Pubchem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库，验证其结构信息，最终构建了莱菔子的成分数据库。采用Xcalibur 3.0软件，根据各成分的元素组成计算精确质量数，结合分子离子、碎片离子信息，分析标准品的质谱裂解规律并比对相关文献报道从而鉴定化学成分。首先通过一级MS确定准分子离子峰，再通过Xcalibur 3.0质谱工作站中的化学式预测功能，预测出化学式；再根据MS2裂解碎片信息，进行相关基团和母核结构的推导，总结出特征碎片离子；最后参照莱菔子提取物所含成分的质谱裂解规律对结构进行推测和指认。采用Compound Discoverer 3.1软件并结合网络在线数据库mzCloud（https://www.mzcloud.org/）、Chemspider （http://www.chemspider.com/）等，合理设计软件工作流程，对质谱检测到的原始数据进行智能处理，获取成分精确质量数、保留时间、二级碎片离子信息，对化合物进行辅助确认。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 样品前处理

根据样品的极性大小，分别选择水、70%甲醇-水、甲醇分别作为提取溶剂超声提取。通过比较提取样品的质谱数据，发现与水、甲醇相比，70%甲醇-水提取出样品的总离子流图中色谱峰形与响应值更好，有效成分峰更多。因此选择70%甲醇-水作为提取溶剂。

2.1.2 洗脱溶剂与洗脱梯度

在流动相中加入适量的甲酸可以促进化学成分的电离，从而有利于离子响应值的提高。分别用0.05%、0.1%和0.2%甲酸溶液考察溶剂对实验结果的影响。结果表明，以上比例甲酸溶液对色谱峰形与响应值没有显著影响，最终选择0.05%甲酸溶液作为流动相。首先，将流动相0.05%甲酸水溶液（A）-0.05%甲酸乙腈溶液（B）设定洗脱梯度为0～5 min、0%B ；5～35 min、0%～100%B ；35～40 min、100%B。之后根据采集到的总离子流图调整流动相比例，发现在某些时间段内出峰紧密且各色谱峰并未分开，则适当延长此段时间；在某些时间段内出峰极少或者不出峰，则适当缩短此段时间。最终优化的流动相洗脱梯度见1.3.1。

2.1.3 碰撞能量

逐级将碰撞能量分别设定为10、20、30 eV和25、45、65 eV。据所得质谱数据，发现低碰撞能量时碎片离子信息较少，故需要提高碰撞能量；高碰撞能量时分子离子峰强度极弱或几乎没有，需要降低碰撞能量。最终确定碰撞能量为20、40、60 eV。

2.2 莱菔子70%乙醇提取物的化学成分分析

采用UPLC-Q-Orbitrap-MS 技术分析莱菔子标准品溶液与样品溶液的化学成分，混合标准品的总离子流图见图1、图2。70%乙醇提取物的总离子流图见图3、图4。主要鉴定信息见表1。

表1 LC-MS鉴定莱菔子中的化学成分

图1 正离子模式下莱菔子混合标准品的总离子流图

图2 负离子模式下混合标准品的总离子流图

图3 正离子模式下莱菔子70%乙醇提取物的总离子流图；

图4 负离子模式下70%乙醇提取物的总离子流图

续表1

下面以硫代葡萄糖苷及其降解产物和生物碱类化合物为例，结合建立的数据挖掘策略，对莱菔子70%乙醇提取物进行化学成分分析，并进行未知化合物的初步鉴定，以说明该策略的可行性。

2.2.1 硫代葡萄糖苷及其降解产物

硫代葡萄糖苷（简称硫苷，别名芥子油苷）是双子叶植物组织中的一类次生代谢产物，但是目前其特殊的功能尚未见报道。然而，这些物质可以在植物中转化为其它具有较高生物活性的化合物形式，如异硫氰酸盐、硫氰酸盐和腈［1］。萝卜硫苷是一种硫代葡萄糖苷，是一种有效的抗癌药物萝卜硫素（又称莱菔硫烷）的前体。归属于异硫氰酸盐类的萝卜硫素和莱菔素分别来自于硫苷中的萝卜硫苷和莱菔苷［19-21］。摄入萝卜等其它富含天然膳食化合物的食物可以延缓或预防人类癌症的发生，这种保护作用与异硫氰酸盐类物质有尤为重要的关系［21］，异硫氰酸盐是芥子油苷的一种水解产物，在十字花科中相对独特。它们的生成过程如图5所示。

图5 酶解硫代葡萄糖苷的异硫氰酸盐途径

脂肪族硫苷、芳香族硫苷和吲哚族硫苷是硫代葡萄糖苷的常见类型，它们化学结构的相同位置含有1个β-D-葡萄糖和1个磺酸肟基团，不同之处来自于氨基酸的侧链。首先以萝卜硫苷和萝卜硫素为例，根据UPLC-Q-Orbitrap-MS采集出的总离子流图和各色谱保留时间对应成分的质谱图，推测硫代葡萄糖苷及其降解产物的裂解途径。对于保留时间为2.59 min的化合物，其负离子模式下一级质谱准分子离子峰为m/z 436.0411，预测化学式为C12H23NO10S3，质量数误差为2.536×10-6。相关文献表明［21-23］，硫苷的特征碎片离子包括 m/z 275、259、241、195、96、75，以及失去 GLC、SO3-基团［M-H-242］-的碎片离子m/z 192，此外利用m/z 259和m/z 97碎片离子可有效的进行初步筛选，用于确定植物提取物中硫苷的存在。根据二级质谱图（见图 6）中的碎片离子 m/z 274.980 1、259.012 5、195.033 0、96.958 5、74.989 3，推测萝卜硫苷可能的裂解规律如图7～图10所示。

图6 萝卜硫苷的质谱图

图7 萝卜硫苷可能的裂解规律1

图8 萝卜硫苷可能的裂解规律2

图9 萝卜硫苷可能的裂解规律3

图10 萝卜硫苷可能的裂解规律4

萝卜硫苷的降解产物萝卜硫素会丢失1分子甲基亚磺酰基，产生碎片离子m/z 114.037 2，根据二级质谱图（见图11）所示，正离子模式下产生分子离子峰为m/z 178.035 3，预测分子式为C6H11NOS2，保留时间为19.75 min，质量数误差为-0.966×10-6，其裂解规律如图12所示。据此推测异硫氰酸盐类可能丢失甲基亚磺酰基，产生［M+H-64］+的特征碎片离子。

图11 萝卜硫素的二级质谱图

图12 萝卜硫素可能的裂解规律

根据硫苷特征碎片离子，分析负离子模式下一级质谱中准分子离子m/z 420.046 3，预测其化学式为 C12H23NO9S3，质量数误差为 2.881×10-6，产生碎片离子 m/z 274.990 7，259.103 4，96.958 4，74.989 3，经由标准品数据、文献数据以及在线数据库的验证，可以推测该化合物是4-甲基硫代丁基硫代葡萄糖苷，保留时间为12.94 min。

2.2.2 生物碱

莱菔子中主要含有水溶性生物碱，且多以硫氰酸盐的形式存在［24］。其中芥子碱硫氰酸盐具有降压活性［25］，是莱菔子重要的药效活性成分之一。因此以芥子碱硫氰酸盐为例，分析其可能的裂解规律。正离子模式下，在一级质谱图中显示准分子离子峰m/z 310.163 8，预测化学式为C16H24NO5+，二级质谱图13中，发现其特征性碎片离子为m/z 251.090 6，236.066 9，207.064 7，175.038 5，147.043 7，保留时间为19.98 min，质量数误差为-3.480×10-6，结合标准品数据、文献数据以及在线数据库的验证，推测出芥子碱硫氰酸盐可能的裂解途径如图14所示。

图13 芥子碱硫氰酸盐的二级质谱图

图14 芥子碱硫氰酸盐可能的裂解规律

2.2.3 未知化合物

未知成分可根据二级质谱产生的特征碎片离子，结合数据库信息和相关文献，在已知成分的结构基础上推测其所属化合物类型以及具体的结构信息。以保留时间为1.25 min的未知化合物1为例，负离子模式下，其二级质谱图（见图15）显示的碎片离子 m/z 259.013 2、96.958 4、74.989 3，与 2.2.1 节中硫苷裂解的特征碎片离子吻合，且m/z 259、97离子可用于确定植物提取物中硫苷的存在［21-23］，故推测该化合物为硫苷类成分。一级质谱图中显示其准分子离子峰为m/z 406.048 3，预测化学式为C11H21NO11S2，质量数误差为2.590×10-6。在标准品总离子流图中，质谱图显示一化合物分子式为C11H19NO10S2，m/z 388，结合硫苷特征性碎片离子，提示该化合物为2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷。未知化合物1与其相对分子质量相差18 Da，猜测未知化合物1可能会脱去1分子H2O形成2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，从而推测其化学结构，推测出的结构经由SciFinder查找确认为未知，该未知化合物可能的裂解规律如图16所示。

图15 未知化合物1的质谱图

图16 未知化合物1可能的裂解规律

3 结语

莱菔子为药食同源类中药材，在全国各地均有生产，具有抗癌、抗氧化、降压等多种药理作用，有着广阔的应用前景，其中的主要活性化合物是生物碱、硫苷和黄酮类化合物，但目前莱菔子的质量标准多以芥子碱硫氰酸盐为指标［1，28］。笔者采用UPLCQ-Orbitrap-MS技术对莱菔子的化学成分进行初步分析鉴定，结果表明，莱菔子中主要包括硫苷类及其降解产物、芥子碱、黄酮、芥子酰及阿魏酰类化合物、有机酸、芳香小分子，共鉴定出总计70种化学成分，为莱菔子的质量控制和进一步开发利用奠定物质基础，并为其药理作用的深入研究提供科学依据。