高效液相色谱-串联质谱法测定果汁及乳饮料中9种焦油色素

张琦，李文君，李墨浠，牛悦齐，胡婷婷，芦春梅，王准，翟亚楠，周晓

（长春海关，长春 130062）

焦油色素是以煤焦油为原料制成的，焦油色素制备成本低，颜色鲜艳，着色力强且稳定不易褪色，在食品加工业中被广泛采用。食用合成色素对人体可能具有致癌性，毒理学研究发现，某些合成色素有慢性毒性或致癌性，许多食用合成色素在生产过程中还可能混入有害重金属，人长期食用会产生毒害。因此各国都严格控制其使用范围和使用量［1-3］。

各国食用色素允许使用品种和范围的差异，使我国出口食品中的色素含量项目面临很大风险。美国儿童食品及药物检测机构公布了关于儿童食品禁止使用8种14个项目的食用焦油色素及食品添加剂标准的通知。韩国食品和药物管理局已签署了关于儿童食用色素（包括铝色淀）被禁止使用的文件。食用焦油色素的14个项目包括绿3、食用焦油色素、绿3铝湖、湖红40、湖红40铝色淀、蓝1、蓝2铝湖、青1、青1铝湖、青2、青2铝湖、黄4、黄4铝湖、黄5、黄5铝湖、红3以及红102等。我国允许使用新红、苋菜红、柠檬黄、靛蓝、亮蓝等食用合成色素，允许使用的食品种类有果味水、果味粉，糖果、糕点上的彩装、罐头等［4-7］。

目前国内外食品中焦油色素的检测方法主要有薄层色谱法、紫外分光光度法、导数分光光度法、示波极谱法、检测盒法、高效液相色谱法及高效液相色谱-质谱联用法［8-15］。薄层色谱法繁琐费时，测定结果偏低。紫外分光光度法、导数分光光度法这两种方法对于二组分体系较为有效，对于多组分混合体系，需要结合数学方法。示波极谱法已被用于检测饮料中柠檬黄、苋菜红、胭脂红三种焦油色素。检测盒法操作简单、快速，检测一个样品平均仅需要5～10 min，对几种常用焦油色素最低检出质量浓度均可达到2.0 mg／L，但高浓度的乙醇、淀粉以及蛋白质对色素的检测有一定的干扰作用。高效液相色谱法及高效液相色谱-质谱联用法可采用单一波长或双波长检测，结合梯度洗脱，能同时测定几种混合色素，方法准确，但必须结合样品预处理，否则不能有效排除干扰。笔者探讨并建立了固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定果汁及乳饮料中酸性橙Ⅱ、酸性黄36、偶氮玉红、赤藓红、诱惑红、日落黄、喹啉黄、罗丹明B、柯衣定等9种焦油色素的分析方法。经过实验验证，该方法能够有效去除干扰物质，准确测定相应基质中目标焦油色素含量，可以为果汁及乳饮料中9种焦油色素的检测提供有效的技术支撑。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱-串联质谱仪：API 4500型，美国AB公司。

超声振荡器：AS10200－20L型，天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

分 析 天 平：（1）SQP型，感 量 为 0.1 mg；（2）AB265-S型，感量为0.01 g，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司。

高速冷冻离心机：Allegra X30R型，德国贝克曼库尔特公司。

氮吹仪：MGS-2200型，日本东京理化公司。

PH计：PH3310型，德国WTW公司。

乙腈、甲醇：质谱级，美国Fisher公司。

甲酸、氨水：分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

乙酸铵、铁氰化钾、柠檬酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

酸性橙Ⅱ、酸性黄36、偶氮玉红、赤藓红、诱惑红、日落黄、喹啉黄、罗丹明B、柯衣定标准品：纯度不小于98%，德国Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器工作条件

（1）液相色谱。色谱柱：Agilent Pursuit XRs 5 C18色谱柱（100 mm×2.0 mm，l3 μm，美国安捷伦科技有限公司）；柱温：室温；进样体积：10 μL；流动相：A相为20 mmol／L的乙酸铵水溶液，B相为乙腈；流量：0.25 mL／min；流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

（2）质谱。电离方式：电喷雾（ESI）；电喷雾电压：5 500 V／-4 500 V；检测方式：多反应监测（MRM）；扫描方式：正／负离子扫描；气帘气（CUR）压力：0.31 MPa(45 psi)；雾化气（GS1）压力：0.31 MPa(35 psi)；辅助气（GS2）压力：0.31 MPa(35 psi)；碰撞气（CAD）压力：0.15 MPa(6.0 psi)；离子源温度：550℃；目标化合物的监测离子对、去簇电压和碰撞能量见表2。

表2 目标化合物的监测离子对、去簇电压和碰撞能量

续表2

1.4 样品处理

1.4.1 样品提取

称取样品2 g（精确到0.01 g)至50 mL离心管中，加入5 mL水混匀，加入沉淀剂（铁氰化钾）后，4 000 r／min离心3 min，转移上清液，用20%柠檬酸溶液调pH值至5，待净化。

1.4.2 样品净化

首先活化WAX固相萃取柱（6 mL／150 mg），依次加入6 mL甲醇、6 mL水活化固相萃取柱，将待净化液转移至固相萃取柱，依次用6 mL 0.5%甲酸甲醇溶液、6 mL水清洗，弃去全部流出液，加入5 mL 25%氨化甲醇洗脱至10 mL试管中，于40℃下氮吹至近干，用甲醇定容至2.0 mL，过0.22 μm滤膜后上机测定。

2 结果与讨论

2.1 样品净化方法的选择

根据焦油色素的分子结构特征，分别选取C18固相萃取柱、WAX固相萃取柱、HLB固相萃取柱进行样品加标回收试验，结果如表3。

表3 9种焦油色素不同固相萃取柱的回收率

HLB柱是反相固相萃取柱，吸附目标色素回收率为70%～80%，柯依定回收率低于60%；C18柱整体回收率为60%～80%；WAX柱具有弱阴离子交换及反相两种交换机理，9种目标色素整体回收率为80%～90%。由表3数据可知，WAX柱整体回收率均较高，9种目标物回收率稳定，因此选用WAX固相萃取柱。采用0.5%甲酸甲醇溶液淋洗固相萃取柱，可除去实际样品中部分天然色素。

2.2 液相色谱条件优化

分别以甲醇-水、甲醇-乙酸铵溶液、乙腈-水、乙腈-乙酸铵溶液作为流动相考察对目标物色素的洗脱效果。有机相用甲醇时色谱峰较宽，有机相用乙腈时色谱峰变窄，因此选择乙腈作为有机相。采用乙腈-水流动性体系，诱惑红、日落黄色谱峰拖尾现象严重，部分色谱峰分离度较差，水相添加20 mmol／L乙酸铵溶液后色谱峰变得尖锐，解决了峰间分离度不佳的情况，最终采用20 mmol／L乙酸铵溶液-乙腈作为流动相。

进行多目标物分析时，为满足分离度要求，需要目标物出峰时间适当延后，起始流动相采用80%乙酸铵溶液-20%乙腈保持3 min，利于较强极性杂质的洗脱；11 min内将乙腈比例由20%提高到80%，使多数目标物色素洗脱，20%乙酸铵溶液-80%乙腈保持2 min，将极性最弱的罗丹明B、柯衣定洗脱出来，最后平衡色谱柱回归起始流动相80%乙酸铵溶液-20%乙腈，保持4 min。

9种目标色素优化后的洗脱程序见表1，色素标准溶液色谱图见图1、图2。

图1 7种负扫描模式焦油色素总离子流图

图2 罗丹明B、柯衣定正扫描模式色谱图

2.3 质谱检测条件优化

首先用针泵将每种目标焦油色素单独进样，进行全扫描寻找母离子，优化去簇电压，确定母离子；再进行碎片离子扫描，寻找强度最大的几个特征离子，并优化碰撞能量，选择出合适的子离子，一般为2～3个，以所选母离子及其子离子进行MRM多反应监测扫描，并再次优化去簇电压和碰撞能量，使得所选离子对灵敏度最高。本研究选择了多对离子中强度高、灵敏度高的两对离子作为定性离子，为保证目标物的定量和定性的准确性，选择其中灵敏度最高的一对离子作为定量离子。测定时，可根据保留时间和两对离子对进行定性确证；采用标准物质和待测样品的MRM总离子流图中的色谱峰面积，用外标法定量。实验结果表明，本方法确定的特征目标检测离子测定灵敏度高，选择性好，干扰物少，线性范围宽，重现性好，定量准确，阳性确证结果准确可靠。

2.4 线性方程、线性范围与检出限

在本研究所确定的LC-MS／MS检测条件下，分别对多种焦油色素标准物质在不同浓度范围内制备5个不同浓度水平的标准溶液进行测定，以目标色素的质量浓度为横坐标（x）、以定量离子色谱峰面积为纵坐标（y）绘制标准工作曲线，计算目标色素线性回归方程及相关系数r。根据各焦油色素定性离子信噪比S／N≥3计算方法检出限。方法的线性范围和检出限见表3。

表3 线性方程、线性范围和检出限

2.5 精密度和回收试验

选择未检出酸性橙Ⅱ、酸性黄36、偶氮玉红、赤藓红、诱惑红、日落黄、喹啉黄、罗丹明B、柯衣定等9种焦油色素的样品，分别添加 0.5、1.0、5.0 μg／kg的标准品进行回收试验，每个浓度做6次平行试验，计算方法的平均回收率和精密度，结果见表4。样品加标色谱图分别见图3、图4。

图3 7种负扫描模式焦油色素加标色谱图

图4 2种正扫描模式焦油色素加标色谱图

表4 精密度和回收试验结果

由表4可知，焦油色素的回收率为78.00%～97.08%，相对标准偏差为4.49%～11.27%。回收率和相对偏差均在允许范围内。

3 结语

建立了固相萃取柱-高效液相色谱-串联质谱法测定果汁和乳饮料中酸性橙Ⅱ、酸性黄36、偶氮玉红、赤藓红、诱惑红、日落黄、喹啉黄、罗丹明B、柯衣定等9种焦油色素的分析方法。本方法利用固相萃取柱对样品中的焦油色素进行富集，有效去除基体干扰，以选择离子对待测物定性，用外标法进行定量，开发出了一个高效、快速、准确、可同时检测多种焦油色素的分离和分析确证方法。该方法检测下限完全满足国内外最高残留限量对食品的检测要求，能够为控制非法添加焦油色素的食品流入销售市场提供有效的保障。随着食品工业的发展，更多新型焦油色素被非法用于食品中，继续完善焦油色素准确、快速检测方法，对于保障人民身体健康、提高进出口监管的针对性和有效性，保障进口食品安全，将起到重大意义。