柱前衍生-高效液相色谱-串联质谱法测定塑料产品中两种苯酐化合物

钟琳，杨文宇，李支薇

（广州广电计量检测股份有限公司，广州 510656）

甲基六氢苯酐（MHHPA）和六氢苯酐（HHPA）作为有机合成的中间体，因其具有熔点低、与脂环族环氧树脂组成的配合物粘度低、适用期长、固化物的耐热性高、高温电性能好等优点，被广泛用于环氧树脂固化剂、胶黏剂、增塑剂等产品的生产。近年来，两种苯酐化合物应用领域的不断扩展，产品用量也在逐年递增［1-3］，已成为我国进出口量较大的化工品之一。然而该类化合物却会对皮肤产生刺激性，引发呼吸道过敏［4-8］，因此早在2012年荷兰就提议将其提名为高关注物质（SVHC）。2019年10月，欧洲化学品管理局发布的第九次建议将甲基六氢苯酐和六氢苯酐列入REACH授权清单，因此为保证商品的安全性以及提前应对国际贸易的管控要求，建立一种快速准确、操作简便的检测方法是非常有必要的。目前苯酐的检测方法主要是气相色谱-质谱法［9-13］和气相色谱法［14-16］，以上这两种检测方法均存在测试时间长、检出限高的问题。液相色谱-质谱联用是近年来使用较多的检测方法，尤其是高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS／MS）法。HPLC-MS／MS法对被测物进行了三次选择：液相色谱（LC）选择组分的保留时间，一级质谱（MS）选择分子量，二级质谱(MS／MS)选择子离子，因此准确度和灵敏度更高。笔者选用甲醇作为柱前衍生试剂，采用高效液相色谱-串联四级杆质谱，建立了一种塑料产品中甲基六氢苯酐和六氢苯酐的高灵敏、快速检测方法，为进一步开展该类物质的检测管控，提供了工作基础和技术支撑。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Agilent 1290 Infinity型，6460 Agilent Triple Quad三重四级杆串联质谱仪，配AJS-ESI离子源，Agilent MassHunter Workstation数据采集及处理系统，美国安捷伦科技有限公司。

超声波清洗器：2300 HT型，上海安谱科学仪器有限公司。

电子分析天平：X205BDU型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒公司。

甲醇：HPLC级，美国Sigma公司。

超纯水机：UPR-I-60L型，四川优普超纯科技有限公司。

甲基六氢苯酐标准品：纯度（质量分数）不小于98.0%，上海安谱科学仪器有限公司。

六氢苯酐标准品：纯度（质量分数）不小于97.0%，加拿大TRC公司。

实验用水为超纯水（电阻率不小于18.2 MΩ·cm）。

1.2 标准工作液的制备

标准储备液：分别准确称取甲基六氢苯酐、六氢苯酐两种标准物质10 mg（精确至0.01 mg），用甲苯溶解并定容至10 mL，得到1 000 mg／L的两种标准储备液，于4 ℃冰箱中避光保存。

混合标准中间液：分别吸取100 μL上述两种标准储备液置于10 mL容量瓶中，加甲苯定容至标线，混匀，得到10 mg／L混合标准中间液，保存于4℃冰箱中。

MHHPA、HHPA系列混合标准工作溶液：用甲醇溶液逐级稀释混合标准中间液，得到5、10、20、50、100 μg／L的系列混合标准工作溶液。再将其放入超声波清洗仪中，于40 ℃下超声20 min进行衍生反应。反应液冷却后经0.22 μm滤膜过滤，滤液直接用HPLC-MS／MS进行测定。

1.3 样品前处理

取适量塑料样品，剪碎，尺寸约为1 mm×1 mm×1 mm，准确称取1 g样品（精确至0.1 mg）放入样品瓶中，向其中加入10 mL甲醇，拧紧瓶盖后将样品瓶放入到超声波清洗仪中，在40 ℃下超声20 min进行衍生反应。取1 mL已冷却的反应液经0.22 μm滤膜过滤，滤液供HPLC-MS／MS测定。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 色谱

色 谱 柱：Agilent poroshell 120 SB-Aq柱（150 mm×3.0 mm，2.7 μm，美国安捷伦科技有限公司），带有1.8 μm保护柱（美国安捷伦科技有限公司）；进样体积：2 μL ；柱温：40 ℃；流动相：水（A）-甲醇（B）；流量：0.3 mL／min；洗脱方式：等度洗脱；洗脱比例：A-B体积比为40∶60。

1.4.2 质谱

ESI离子源；毛细管电压：3 500 V；去溶剂气温度：300 ℃；去溶剂气流量：5 L／min；鞘气温度：310 ℃；鞘气流量：11 L／min；多反应监测（MRM）模式；两种苯酐化合物衍生产物的母离子、子离子、碎裂电压和碰撞能量等参数见表1。

表1 MHHPA和HHPA的质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

考虑到甲基六氢苯酐、六氢苯酐两种苯酐化合物与甲醇衍生后的产物含有羧基，易失去一个H+产生［M］-，因此实验中选择ESI作为离子源，在负模式的条件下对两种衍生产物进行分析，寻找质谱响应较高的特征碎片峰。在ESI负离子模式下，先对两种衍生产物在m／z100～300范围内进行全扫描，获得稳定的母离子［M］-，接着通过选择离子扫描模式优化碎裂电压，使母离子响应达到最高。之后，进行子离子扫描，选取响应值高的特征离子作为定量、定性离子对，最后优化碰撞能，使子离子响应达到最高。得到的两种衍生产物的二级质谱优化参数（见表1），其中MHHPA选取m／z 199.1／167.0、199.1／122.9作为定性离子对，选择m／z 199.1／167.0作为定量离子对；HHPA选取m／z 185.0／153.0、185.0／109.1作为定性离子对，选择m／z 185.0／153.0作为定量离子对。

2.2 色谱柱的选择

考察了不同色谱柱Eclipse XDB-C18色谱柱、Poroshell 120 PFP色谱柱和Poroshell 120 SB-Aq色谱柱对两种苯酐化合物衍生产物的分离性能。结果表明，两种衍生产物在Eclipse XDB-C18色谱柱和Poroshell 120 PFP色谱柱上分离效果均不好，且峰形较差，这可能是由于苯酐化合物与甲醇衍生后的产物含有酯基和羧基，化合物极性增大，并且两种衍生产物的结构相似，极性也接近，上述两种色谱柱无法对其进行有效地分离。推测硅胶上键合了极性基团的色谱柱可能更有利于两种衍生产物的分离。最终选用了Agilent poroshell 120 SB-Aq液相色谱柱，该色谱柱在超高压条件下可为两种极性衍生产物提供更好的分离效率，图1给出了浓度为0.1 mg／L混合标准溶液的总离子流色谱图，HHPA和MHHPA在色谱柱中的保留时间分别为2.06 min和2.26 min。图2为在MRM模式下，串联质谱分别根据HHPA和MHHPA的离子对提取的色谱峰。在该模式下，液相色谱-串联质谱对被测物进行了三次选择，分别为保留时间、母离子和子离子。即使被测组分的保留时间相近，液相色谱-串联质谱也能通过母离子和子离子对被测物质进行准确地选择。

图1 使用poroshell 120色谱柱时HHPA、MHHPA的总离子流色谱图

图2 HHPA、MHHPA的MRM色谱图

2.3 衍生条件的选择

为优化两种苯酐化合物与甲醇衍生反应条件，分别考察了衍生时间和温度对结果的影响。横坐标为实验变量，纵坐标的仪器响应值进行归一化处理，使得最高响应值为1。考虑到甲醇的沸点为64 ℃，衍生反应温度的考察范围为30～60 ℃之间，衍生时间考察到60 min。试验结果如图3、图4所示，当超声温度为40 ℃时，仪器的响应值达到最大，当超声20 min后，衍生产物峰面积趋于一致，基本达到最大的衍生效率。实验结果说明在40 ℃下超声20 min，苯酐化合物与甲醇的衍生产率可以达到最大。因此选择40℃超声20 min为最优的衍生条件。

图3 不同衍生温度下的响应值

图4 不同衍生时间下的响应值

2.4 线性范围和检出限

在1.4仪器工作条件下测定1.2配制的系列混合标准工作溶液，以MHHPA和HHPA的质量浓度X （μg／L）为横坐标，峰面积Y为纵坐进行线性回归，分别以3倍和10倍信噪比（S／N）来确定两种化合物的检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表2。由表2可知，在5～100 μg／L的质量浓度范围内，两种化合物均有良好的线性关系，相关系数不低于0.999 5。

表2 MHHPA和HHPA的线性方程、检出限和定量限

2.5 回收试验与精密度试验

选用不含两种苯酐化合物的塑料样品作为空白基质，设定了3个不同的加标浓度水平进行加标回收试验。每个加标水平平行测试6次，进行精密度试验，结果见表3。从表3中可看出，在3种加标水平下，MHHPA的平均加标回收率为99.9%～100.9%，相对标准偏差不大于2.5%；HHPA的平均加标回收率为99.7%～101.9%，相对标准偏差不大于3.0%。该方法具有良好的精密度与准确度，可以满足塑料产品中MHHPA、HHPA的检测要求。样品加标量为20 μg／L的总离子流色谱图如图5所示。

表3 回收试验与精密度试验结果（n=6）

图5 样品加标总离子流色谱图

3 结语

采用高效液相色谱-串联质谱仪建立了塑料产品中甲基六氢苯酐（MHHPA）和六氢苯酐（HHPA）的检测方法。通过将两种苯酐化合物与甲醇在40℃下超声20 min，发生衍生反应，随后使用Agilent poroshell 120 SB-Aq的液相色谱柱对两种化合物的衍生产物进行分离，水和甲醇为流动相，质谱为检测器进行定性、定量检测。该方法能充分满足分析要求，可用于塑料产品中甲基六氢苯酐和六氢苯酐的检测。