高效液相色谱法同时测定化妆品中的法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁

时间：2024-05-22

范菲，李静静，王喻，安庆，郑妍

（西安市食品药品检验所，西安 710054）

人们生活水平越来越高，对美的追求也不断提高，一些功能性化妆品应运而生。然而一些不良企业为了追求效果，不惜在化妆品中违禁添加药物成分，对消费者的身体健康造成了极大的危害，因此化妆品的安全问题越来越引起人们的关注。法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁为H2（Histamine H-2）受体阻断剂，主要用来抑制胃酸分泌，同时还能抑制胃蛋白酶的分泌。临床上主要用于治疗十二指肠溃疡、胃溃疡、上消化道出血等疾病。近年来，随着进一步深入研究，发现人类皮肤血管中具有H1（Histamine H-1）和H2组胺受体，而西咪替丁是一种强效H2受体拮抗剂，故对许多皮肤疾病治疗有效［1-2］。2019年，国家药监局将西咪替丁列为了化妆品中主要检测物质之一，公布了其检测方法，由于法莫替丁和雷尼替丁与西咪替丁功能相似，不良企业可能将西咪替丁替换为法莫替丁或雷尼替丁。文献报道中对中药及保健食品中非法添加法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁的检测较多［3-15］，但未见同时检测测定化妆品中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁含量方法，因此笔者建立高效液相色谱法同时测定化妆品中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁含量方法，为法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁质量控制提供较为可靠的实验支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：ULTIMATE U-3000型，配备二极管阵列检测器（DAD），赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

电子天平：BSA124S-CW型，感量为1 mg，赛多利斯科学仪器有限公司；MS105型，感量为0.1 mg，梅特勒-托利多仪器有限公司。

法莫替丁对照品：纯度（质量分数）为99.2%，批号为100305-201003，中国药品生物制品检定所。

雷尼替丁对照品：纯度（质量分数）为99.8%，批号为100163-201006，中国食品药品检定研究院。

西咪替丁对照品：纯度（质量分数）为99.8%，批号为100158-201105，中国食品药品检定研究院。

化妆品样品：爽肤水、乳液、霜，市售。

甲醇、乙腈：色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

实验用其它试剂均为分析纯。

磷酸二氢钾溶液：0.05 mol／L，称取磷酸二氢钾6.8 g，加水1 000 mL溶解，用氨水调pH值至7.0。

实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Thermo scientific AcclaimTM120 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国赛默飞世尔科技公司）；流动相：A为乙腈，B为0.05 mol／L磷酸二氢钾溶液；梯度洗脱程序：0～25 min为10%的流动相 A，25～30 min为 10%～90% 的A，30～35 min为90%的流动相A，35～36 min为90%～10%的流动相A，36～42 min为10%的流动相A；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：226 nm；柱温：30 ℃；流量：1.0 mL／min；进样体积：10 μL。

1.3 溶液的配制

样品溶液：称取样品（化妆品：爽肤水、乳液、霜）0.5 g于25 mL比色管中，加20 mL甲醇，在涡旋混匀器上高速振荡30 s，使样品与提取溶剂充分混匀。然后超声提取20 min，静置至室温，加甲醇定容至标线并摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为样品溶液。

混合对照品储备溶液：分别精密称取法莫替丁对照品19.87 mg、雷尼替丁对照品21.02 mg、西咪替丁对照品21.03 mg置于同一50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至标线，摇匀，即得法莫替丁、雷尼替丁、西咪替丁的质量浓度分别为394.22、419.56、419.76 mg／mL的混合对照品储备溶液。

系列混合标准工作溶液：精密量取混合对照品储备溶液适量，分别用甲醇稀释2 500、500、200、50、20、10、5倍，配制成的系列混合标准工作溶液列于表1。

表1 系列混合标准工作溶液对应质量浓度 mg／mL

阴性对照品溶液：取已确定未添加法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁的化妆品样品0.5 g作为阴性样品，按照样品溶液的配制方法，配制成阴性对照品溶液。

阴性对照品加标溶液：取阴性样品0.5 g，添加混合对照品储备溶液1 mL，按照样品溶液的配制方法，配制成阴性对照品加标溶液。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

由于化妆品成分较为复杂，等度洗脱难以充分分离，故采用梯度洗脱方法。参考国家药监局关于发布化妆品中西咪替丁检测方法的通告（2019年第 48 号）、中国药典［16］和相关文献资料［11-15］，考察了十八烷基键合硅胶柱包括Thermo scientific AcclaimTM120 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，赛默飞世尔科技公司）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（150 mm×4.6 mm，4 μm，安捷伦科技有限公司）、SPOLAR C18（150 mm×4.6 mm，5 μm，资生堂公司）、CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，资生堂公司）、Sepax BR-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，赛分科技有限公司）和Agilent Eelipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，4 μm，安捷伦科技有限公司），对流动相系统包括乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05 mol／L磷酸二氢钾溶液分别进行考察实验。结果表明，长度为250 mm的色谱柱分离效果优于150 mm的色谱柱，不同品牌的250 mm的C18色谱柱均能很好分离法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁，说明此方法色谱柱耐受性强；流动相为乙腈-0.05 mol／L磷酸二氢钾溶液系统时，各组分峰型及分离度良好，未见其它成分干扰，最终选择Thermo scientific AcclaimTM120 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈-0.05 mol／L磷酸二氢钾溶液为流动相，进行梯度洗脱。

2.2 检测波长的选择

参考国内外相关药品法典［16］以及文献资料［3，10］，使用二极管阵列检测器对法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁进行200～400 nm全波长扫描，紫外光谱图见图1～图3，发现法莫替丁最大吸收波长为205、284 nm，雷尼替丁最大吸收波长为226、317 nm，西咪替丁最大吸收波长为216 nm，对比不同波长色谱图，综合各组分吸收情况，表明226 nm波长条件下，各组分的吸收值均较大，且无杂质干扰，故选择226 nm作为检测波长。

图1 法莫替丁紫外光谱图

图2 雷尼替丁紫外光谱图

图3 西咪替丁紫外光谱图

2.3 专属性试验

精密量取阴性对照溶液、混合对照品溶液和阴性对照加标溶液，按1.2项色谱条件进样分析，色谱图见图4～图6，法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁保留时间分别为 11.939、16.558、20.440 min，与相邻杂质峰分离度大于7.28，色谱峰形良好。

图4 阴性对照品溶液色谱图

图5 混合对照品溶液色谱图

图6 阴性对照品加标色谱图

2.3 稳定性试验

取同一样品溶液，按1.2项色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定样品溶液峰面积，结果见表2。由表2可知，相对标准偏差均小于0.3%，表明法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁在24 h内稳定。

表2 稳定性试验结果

2.4 线性方程、检出限与定量限

精密量取系列混合对照品标准工作溶液，按1.2色谱条件进样分析，记录色谱数据。以各组分的质量浓度（x）对峰面积（y）进行线性回归处理，计算线性方程和相关系数。用标准工作溶液逐级稀释，以3倍信噪比计算检出限（LOD），以10倍信噪比计算定量限（LOQ）。线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限见表3。

表3 线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.5 加标回收试验

分别精密称取阴性对照0.5 g置于25 mL比色管中，分别精密加入对照品储备液高、中、低三个水平各3份，按1.3制备样品溶液，按1.2项色谱条件测定，进行加标回收试验，结果见表4。由表4可知，3个浓度组间的法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁平均回收率为94.63%～102.09%，说明该方法具有较高的准确度。

表4 回收试验结果（n=3）

续表4

2.6 精密度试验

精密称取法莫替丁16.12 mg、雷尼替丁16.95 mg和西咪替丁16.98 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解至标线，摇匀，作为混合对照品溶液，再精密称取爽肤水、乳液、霜类样品各5 g，分别加入混合对照品溶液4 mL，混匀，各取5份，按1.3制备样品溶液，在1.2色谱条件下测定，结果见表5。

表5 精密度试验结果

由表5可知，爽肤水中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁测定结果的相对标准偏差分别为0.88%、0.74%、0.76%，乳液中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁测定结果的相对标准偏差分别为0.74%、0.40%、0.52%，霜中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁测定结果的相对标准偏差分别为0.75%、0.49%、0.34%，表明该方法的精密度良好。