高效液相色谱法检测化妆品中4-甲基苄亚基樟脑的不确定度评定

邢海艳，孙丽，刘洋，苏晶

(淮安市食品药品检验所，江苏淮安 223005)

随着生活水平的提高，人们对外在越来越注重，化妆品行业得到了飞速的发展。化妆品从功能上分为清洁类化妆品、护理类化妆品、美容修饰类化妆品等三大类［1］。根据《化妆品监督管理条例》及实施细则，将化妆品分为特殊化妆品和非特殊化妆品，其中特殊化妆品包括育发、染发、烫发、脱毛、美乳、健美、除臭、祛斑美白和防晒等九类化妆品［2-3］。防晒剂是指利用光的吸收、反射或散射作用，以保护皮肤免受特定紫外线所带来的伤害或保护产品本身而在化妆品中加的物质［3-4］。防晒剂对皮肤有保护作用，但过量使用也会影响皮肤健康，如过敏、泛红、光敏、发炎等［5］。

测量不确定度又称不确定度，指由于测量误差的存在，对被测量值的不能肯定的程度，表征合理的赋予被测量之值的分散性［6-7］。不确定度的考察是对实验室质量控制和质量管理重要的一个参数，特别是对边缘样品、不合格样品的不确定度评估。《化妆品安全技术规范》（2015版）规定了化妆品中可使用27种防晒剂，提供了21种物质的检测方法［4］。近几年，不确定度在化妆品检测领域的应用越来越多［8-11］，笔者按照《化妆品安全技术规范》（2015版）中5.1的方法，对能力验证样品中4-甲基苄亚基樟脑的含量测定进行不确定度考察。4-甲基苄亚基樟脑是准用紫外吸收剂，被广泛添加在化妆品中［4，13］，允许添加的限度为4%；通过比较分析4-甲基苄亚基樟脑含量测定不确定度的来源，建立4-甲基苄亚基樟脑不确定度评定的数学模型，抓住影响不确定度的关键因素，从而进一步提高实验室质量管理水平。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters 2695／2998型，美国Waters公司。

超声清洗仪：KQ-250DV型，昆山市超声仪器有限公司。

Millipore超纯水机：美国Millipore公司。

0.22 μm有机系针筒式微孔滤膜：上海安谱公司。

乙腈、四氢呋喃：色谱纯，德国默克公司。

高氯酸：优级纯，南京化学试剂股份有限公司。

4-甲基苄亚基樟脑标准品：质量分数为99.0%，德国DR EHRENSTORFER公司。

混合溶剂：甲醇-四氢呋喃-水-高氯酸按体积比250∶450∶300∶0.2配制。

1.2 高效液相色谱条件

色 谱 柱：CAPCELL PAK MG Ⅱ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本资生堂公司）；流动相：A相为甲醇，B相为四氢呋喃，C相为水-高氯酸（体积比为300∶0.2），按表1进行梯度洗脱；流量：1.0 mL／min ；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.3 样品前处理

称取样品0.25 g，置于25 mL具塞试管中，加入混合溶剂20 mL，超声30 min，放冷，稀释至标线，过滤，取续滤液1 mL，用混合溶剂稀释至10 mL，混匀后，经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为待测溶液。

1.4 标准曲线的配制

取4-甲基苄亚基樟脑标准品10.32 mg，置于100 mL量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至标线，配制成4-甲基苄亚基樟脑的质量浓度为0.102 2 mg／mL的标准储备溶液。再分别取上述标准储备溶液1、2、5、10、20、50 mL，用混合溶剂稀释至 100 mL，配制成4-甲基苄亚基樟脑的质量浓度分别为1.022、2.044、5.110、10.22、20.44、51.10 μg／mL 的系列标准工作溶液，以4-甲基苄亚基樟脑的质量浓度为横坐标、对应的色谱峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。

1.5 数学模型的建立

样品中4-甲基苄亚基樟脑的质量分数按式(1)计算。

式中：w——样品中4-甲基苄亚基樟脑的的质量分数，%；

ρ——样品中被测组分的质量浓度，μg／mL；

V——样品溶液定容体积，mL；

m——样品称样量，g；

f——稀释倍数，f=10。

2 不确定的来源

从检测过程和数学模型分析［14］，4-甲基苄亚基樟脑含量测定的不确定度来源主要有以下几方面。

（1）样品溶液测定引入的标准不确定度：包括4-甲基苄亚基樟脑标准品的纯度引入的标准不确定度，4-甲基苄亚基樟脑标准品的称量引入的标准不确定度，标准品系列溶液的配制引入的标准不确定度，标准曲线的拟合引入的标准不确定度。

（2）样品处理引入的标准不确定度：包括样品称量引入的标准不确定度，样品溶液制备引入的标准不确定度，样品测定重复性引入的标准不确定度，样品的提取回收率引入的标准不确定度。

（3）高效液相色谱仪引入的标准不确定度。

3 不确定度评定

3.1 样品溶液测定引入的标准不确定度

3.1.1 标准品纯度引入的相对标准不确定度urel(P)

证书上标注4-甲基苄亚基樟脑标准品的纯度为99.0%，不确定度为1.25%，取包含因子则由标准品纯度引入的相对标准不确定度：

3.1.2 标准品称量引入相对标准不确定度urel(mR)

4-甲基苄亚基樟脑的取样量mR=10.32 mg，其称量不确定度来源有3项：（1）重复性；（2）分辨率；（3）示值误差。评定结果如表2所示。

表2 标准品称量时各分量不确定度

由于称量是两次，则4-甲基苄亚基樟脑标准品称量引入的相对标准不确定度：

3.1.3 标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度urel(C)

依 据 GB／T 12806—2011、JJG 196—2006等标准的要求［15-18］，评定标准品系列溶液配制时所用的移液管、容量瓶引入的不确定度包括：（1）移液管、容量瓶校准引入的标准不确定度，按三角分布考虑，；（2）温度导致溶液膨胀引入的标准不确定度。水的膨胀系数为2.1×10-4／℃，实验室温度波动在±5℃范围内，按矩形分布考虑，。各分量的标准不确定度评定见表3。

表3 各玻璃器皿使用的不确定度

根据表3数据，合成得标准品溶液配制引入的相对标准不确定度：

3.1.4 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(curve)

按照1.4配制系列标准工作溶液，每个标准溶液测定2次，以4-甲基苄亚基樟脑的质量浓度(ρ)对应的峰面积(A)绘制标准曲线，计算得线性方程为A=46 711ρ-1 003.6，相关系数为0.999 95。对同一样品溶液测定6次，得样品中4-甲基苄亚基樟脑的质量浓度平均值为ρ=8.187 3 μg／mL。按式(2)、(3)计算标准曲线拟合引入的标准不确定度u(curve)：

式中：s(A)——各标准溶液峰面积的标准偏差；

n——标准溶液测定次数，n=2；

m——标准溶液个数，m=6；

Ai——第i个标准溶液的峰面积测定值；

a——标准曲线的斜率；

ρi——第i个标准溶液的质量浓度，μg／mL；

b——标准曲线的截距；

p——样品平行测定次数，p=6；

ρ——样品溶液中4-甲基苄亚基樟脑的质量浓度，μg／mL；

——标准曲线系列溶液的平均质量浓度，μg／mL。

计算得标准曲线拟合引入的相对标准不确定：urel(curve)=u(curve)／ρ=0.064 32／8.187 3=0.007 86

以上各不确定度分量互不相关，合成得样品溶液测定引入的标准不确定度：

3.2 样品处理引入的标准不确定度

3.2.1 样品称量引入的相对标准不确定度urel(ms)

样品的平均称样量为ms=0.254 4 g，其不确定度来源有 3 项：（1）重复性；（2）分辨率；（3）示值误差。样品称量时各分量的不确定度评定结果见表4。

表4 样品称量时各分量的不确定度

按照表4合成得相对标准不确定度：

3.2.2 样品溶液配制引入的相对标准不确定度urel(Vs)

称样后，加混合溶剂提取稀释定容至25 mL，再精密量取1 mL，稀释至10 mL。其不确度来源有：（1）移液管、具塞试管、容量瓶校准引入的不确定度；（2）温度导致溶液膨胀引入的的不确定度，结果见表5（计算方法同表3）。

表5 样品溶液配制时各玻璃器皿引入的不确定度

根据表5数据，合成得相对标准不确定度：

3.2.3 样品测定重复性引入的相对标准不确定度urel(s)

对样品中4-甲基苄亚基樟脑的含量测定了6次，结果分别为 0.790%、0.818%、0.817%、0.810%，0.804%、0.797%，计算得6次测定结果的标准偏差s=0.0111%，平均含量w=0.804%，则样品测定重复性引入的相对标准不确定度：

3.2.4 样品提取回收率引入的相对标准不确定度urel(R)

取空白样品6份，进行了加标回收率实验，各测定 2 次 (n=6，N=2)，结果见表 6。

表6 样品提取的回收率数据

则样品提取回收率引入的相对标准不确定度：

以上各不确定度分量urel(ms)、urel(Vs)、urel(s)、urel(R)互不相关，合成得样品处理引入的相对标准不确定度：

3.3 仪器引入的相对标准不确定度

仪器引入的相对标准不确定度用连续测量标准品溶液的重复性表示，取浓度为5.108 5 μg／mL的4-甲基苄亚基樟脑标准溶液连续测定5次(n=5)，峰面积测定结果分别为237 543、240 154、240 199、245 454、237 783，计算得峰面积平均值A=240 227，标准偏差s(L)=3 182，则仪器引入的相对标准不确定度：

4 合成不确定度

以上各相对标准不确定度分量urel(ρ)、urel(S)、urel(L)互不相关，合成得4-甲基苄亚基樟脑含量测定结果的相对标准不确定：

实验中测得样品中4-甲基苄亚基樟脑的含量w=0.804%，则4-甲基苄亚基樟脑含量测定结果的标准不确定度：

根据JJF 1135—2005 《化学分析测量不确定度评定》和JJF 1059.1—2012 《测量不确定度评定与标示》［7，19］，取包含因子k=2，置信区间为 95% 时，扩展不确定为U=ku(w)=2×0.014 8%=0.030%，当样品中4-甲基苄亚基樟脑的质量分数为0.804%时，结果表示为(0.804±0.030)%，k=2。

5 结论

以能力验证样品为研究对象，按照《化妆品安全技术规范》2015年版5.1的检测方法对4-甲基苄亚基樟脑的含量测定进行不确定度分析。根据建立的数学模型，对不确定度的各分量进行评定。结果表明，4-甲基苄亚基樟脑含量测定的不确定度最主要的来源是标准曲线的拟合、样品的提取回收率和标准品纯度引入的不确定度，其次是标准品称量、仪器测量重复性、样品测量重复性引入的不确定度，最后是样品溶液的配制、标准品溶液的配制和样品的称量引入的不确定度。因此，在实验室质量管理过程中，应注意标准曲线系列溶液的浓度与样品溶液的浓度接近，标准品称量时可选择精度更高的天子天平，对仪器设备定期进行期间核查，实验人员可适量增加平行试验的次数来降低不确定度，标准品采购时要考察各个品牌的纯度与不确定度，从而提高实验的准确度，减少不确定度，最终优化和完善实验室质量管理。