高效液相色谱串联质谱法测定盐酸雷尼替丁胶囊中N-亚硝基二甲胺

时间：2024-05-22

左文松，刘继华

（云南省食品药品监督检验研究院，云南昆明 650000）

盐酸雷尼替丁胶囊可缓解胃酸过多所致的胃痛、胃灼热感、反酸，目前主要用于胃炎、胃溃疡等疾病的治疗，因价格便宜且疗效显著，在国内有较大的使用量。美国食品药品监督管理局（FDA）于2020年4 月1 日下令，要求所有生产商立即从美国市场撤回所有雷尼替丁产品，包括处方药和非处方药，原因是有调查发现雷尼替丁药品中含有致癌物N-亚硝基二甲胺（NDMA）。根据世界卫生组织公布的致癌物清单，NDMA 属于2A 类致癌物质［1］，在极低浓度水平下即可导致基因突变或致癌［2-5］。因此，控制药品中NDMA 的含量对用药安全有着重要的意义。

根据国家药品监督管理局发布的《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则》［6］征求意见，按NDMA TD50 值(导致50%肿瘤发生率的给药剂量相当于患癌风险可能性水平为1∶2)进行计算，其每日可接受的最大摄入量为96 g，盐酸雷尼替丁胶囊说明书中表明该制剂雷尼替丁每日最大摄入量为300 mg，所以NDMA 的限度设定为96 ng/300 mg，即为0.000 032%。雷尼替丁药品出厂后存放的时间越长，NDMA 的含量越高，从而导致雷尼替丁药品中NDMA 含量可能会超出人体每日摄入NDMA的最高限量，会给消费者造成巨大的风险，因此准确测定盐酸雷尼替丁胶囊中N-亚硝基二甲胺的含量十分必要。

盐酸雷尼替丁胶囊中NDMA 的检测主要有液相色谱-高分辨质谱联用及液相色谱-三重四级杆质谱联用两种方法，两种方法均有较高的灵敏度及准确度，但液相色谱-高分辨质谱联用仪价格昂贵，成本较高。目前药品领域中有缬沙坦、二甲双胍、达卡巴嗪、厄贝沙坦、甲磺酸卡莫司他、阿莫西林、奥美沙坦酯等药物中NDMA 检测的报道［7-14］，但未见盐酸雷尼替丁胶囊中NDMA 的检测报道，笔者建立了高效液相色谱串联质谱法测定盐酸雷尼替丁胶囊中N-亚硝基二甲胺，优化了质谱参数，提高检测灵敏度，为保证该品种的安全用药及质量监管提供科学依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-质谱联用仪：Quantis 型，美国赛默飞科技有限公司。

电子分析天平：BP221S 型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

振荡水浴槽：THZ-82A 型，金坛市易晨仪器制造有限公司。

离心机：TDL-5C 型，上海菲恰尔分析仪器有限公司。

涡旋振荡器：MS 3 型，德国艾卡有限公司。

甲酸：色谱纯，美国赛默飞科技有限公司。

甲醇：质谱纯，美国赛默飞科技有限公司。

NDMA 对照品：纯度（质量分数）为97.8%，批号为510166-201902，中国食品药品检定研究院。

盐酸雷尼替丁胶囊：45 批（规格为0.15 g），来源于不同企业、不同批号样品。

实验用水为纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ACE EXCEL3 C18-AR（150 mm×4.6 mm，3 μm，英国ACE 公司）。流动相：A 为0.1%甲酸水溶液，B 为含0.1%甲酸的甲醇溶液；洗脱方式：梯度洗脱，程序见表1；流量：0.5 mL/min，柱温：40 ℃，进样体积：5 μL；六通阀切换设置：0～5 min进入质谱，其余时间进入废液。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 质谱条件

离子源：大气压化学电离（APCI）源，正离子模式；监测方式：MRM；电离电压：2.5 kV；离子传输管温度：380 ℃，辅助气加热温度：380 ℃，电晕针电流：4 000 mA，鞘气流量：10.08 L/min；辅助气流量：5.58 L/min。质谱参数见表2。

表2 NDMA 质谱参数

1.3 样品处理

取适量盐酸雷尼替丁胶囊内容物，混匀，再精密称取适量（约相当于一粒重量）于三角瓶中，加入甲醇10 mL，涡旋混匀1 min，振摇40 min，离心，取上清液滤过，取续滤液即得。

1.4 溶液配制

精密称取NDMA 对照品52.12 mg，置于50 mL量瓶中，加水稀释至标线，摇匀，再精密量取0.5 mL于500 mL 容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀，即得NDMA 质量浓度为1 μg/mL 的对照品储备液。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 色谱柱

检测主药中所含的微量基因毒性杂质（ppm 级别）所采用的色谱柱，既需要主药与待测物达到较高的分离度，使主药能够通过切换阀流入废液，防止质谱仪污染，也需要较大的载样量，防止色谱柱过载而使待测物流失。在此基础上，分别考察了ACE EXCEL3 C18-AR 柱（150 mm×4.6 mm，3 μm，英国ACE 公司）、Waters BEH 柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm，美国沃特世公司）、Hypersil Gold 柱（100 mm×1 mm，1.9 μm，美国赛默飞公司）、Agilent Poroshell 120 柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美国安捷伦公司） 4 种不同品牌型号的色谱柱对测定结果的影响。结果发现，NDMA 对照品溶液在上述4 种色谱柱上均可获得较好的峰形，注入供试品溶液后，主药与待测物在后3 种品牌的色谱柱上保留时间接近，出现共洗脱，综合考察，ACE EXCEL3 C18-AR柱对NDMA 对照品及供试品溶液均有良好的分离效果，符合实验要求。

2.1.2 流动相

分别考察甲醇-水（含0.1%甲酸）溶液以及乙腈-水（含0.1%甲酸）溶液两种流动相系统。将1 ng/mL NDMA 对照品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪，结果表明，甲醇-水（含0.1%甲酸）溶液系统峰形较尖锐，且与主成分盐酸雷尼替丁分离度较高，所以选择甲醇-水（含0.1%甲酸）溶液作为流动相。

2.2 质谱条件优化

分别考察ESI 源以及APCI 源对NDMA 响应值的影响。将1 ng/mL NDMA 对照品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪，结果发现，ESI 源信噪比为8，APCI 源信噪比为21。APCI 源能获得较高的响应值，提高灵敏度。结合NDMA 的结构式，最终采用MRM 正离子模式进行测定。

2.3 提取条件的选择

结合NDMA 及主成分盐酸雷尼替丁的溶解性，分别考察水、甲醇、乙腈3 种溶剂的提取效果。精密称取样品3 份，按照1.3 方法，分别以上述3 种溶剂进行提取，在1.2 仪器工作条件下依次测定。结果表明，所得NDMA 的色谱峰面积分别为6 750、8 215、6 422，甲醇的提取效果较好。由于盐酸雷尼替丁可降解产生NDMA，且随着温度上升，NDMA含量急剧上升［10］，选择振摇的方式进行提取，可避免超声水温上升造成NDMA 含量升高。最终选择用振荡的方式，以甲醇对样品进行提取。

2.4 系统适用性试验

取NDMA 质量浓度为2 ng/mL 的对照品溶液，在仪器工作条件下重复进样6 次，所得色谱峰面积的相对标准偏差为7.4% （小于10%），满足分析要求；取NDMA 质量浓度为1 ng/mL 的对照品溶液进样，所得主峰信噪比为21.6 （大于10），满足分析要求。

2.5 线性范围

分别精密量取对照品储备液0.1、0.2、0.5、1、5、10、50 mL 于不同的100 mL 容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀，得NDMA 质量浓度分别为1、2、5、10、50、100、500 ng/mL 的系列标准工作溶液。精密量取系列标准工作溶液5 μL 进样测定，以质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归分析，线性方程为y=12 431.840 44x+5 061.354 74；相关系数为0.999 9，表明NDMA 的质量浓度在1～500 ng/mL 范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。

2.6 检出限和定量限

精密移取1 ng/mL NDMA 标准工作溶液，以水为溶剂进行逐级稀释，按照3 倍信噪比（S/N）计算检出限为0.2 ng/mL，10 倍信照比（S/N）计算定量限为0.5 ng/mL。

2.7 重复性

精密称取样品6 份，按1.3 方法处理，在1.2 仪器工作条件下测定，记录NDMA 峰面积，重复性试验结果见表3。由表3 可知，NDMA 峰面积的相对标准偏差为4.8%，表明该方法重复性良好。

表3 重复性试验结果

2.8 稳定性

取样品溶液，保存于进样瓶中，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样，记录NDMA 峰面积，稳定性试验结果见表4。由表4 可知，NDMA 峰面积的相对标准偏差为6.8%，表明样品溶液24 h 内稳定。

表4 稳定性试验结果

2.9 加标回收与精密度试验

精密称取已知NDMA 含量的样品6 份，分别精密加入NDMA 对照品溶液，按照1.3 方法进行处理，在1.2 仪器工作条件下测定，加标回收试验结果数据见表5。

表5 加标回收试验结果

由表5 可知，加标样品的平均回收率为97.8%，测定结果的相对标准偏差为5.1%，表明该方法具有较高的准确度和精密度。

2.10 样品测定

将45 批盐酸雷尼替丁胶囊按1.3 方法处理，在1.2 仪器工作条件下测定，结果表明，45 批次样品均检出NDMA。按盐酸雷尼替丁胶囊中NDMA 的限度要求（0.000 032%），16 批次样品检验结果低于0.000 032%，29 批次样品检验结果高于0.000 032%，低于0.000 633%，平均值为0.000 124%，超出限度一倍（0.000 064%）的样品有16 批。有研究表明，在正常储藏条件下，雷尼替丁药品中的NDMA 含量会持续增加，当储存温度升高（有些消费者存放药物时可能会达到的温度）时，雷尼替丁药品中的NDMA 含量会更加显著增加［15］。