基于分子间裂分G-四链体-氯化血红素DNA酶自组装纳米线的“Turn-on”型汞离子传感研究*

张 何,赵智粮,傅 昕,王 青

(湖南工程学院化学化工学院,湖南 湘潭 411104)

汞是一种高毒性重金属元素,可在水、空气和土壤中进行迁移,并通过食物链进入人体。近几年发现如果长期接触Hg2+,可直接引起脑损伤、运动障碍、致畸、致癌和肾衰竭等疾病[1-2]。因此在防治汞污染的同时,快速、高效地检测Hg2+技术具有重要的现实意义。目前比较成熟的汞检测技术包括原子荧光光谱法,电化学法、冷原子吸收法、荧光光谱法等仪器方法[3-5],这些方法具有较好的特异性,准确性以及灵敏度,但是该类技术依靠大型仪器,费用昂贵,不宜进行现场实时检测。利用生物传感器[6-7]检测Hg2+,主要根据胸腺嘧啶(T)特异性识别Hg2+,形成特殊的T-Hg2+-T结构[8-10]。Ono A等首次报道了利用DNA作为Hg2+的识别元件,在液相体系中高特异检测Hg2+的新思路[11]。

DNA 酶(DNAzyme)是一种具有催化性能的DNA分子,因其易于复制和储存、价格低廉、便于特殊标记和操作、不易水解且热稳定性良好等优势,使其在生物模拟酶的研究中占据极其重要的地位[12-13]。G-四链体-Hemin DNA 酶则是近些年来迅速发展起来的一种DNA酶[14-19],G-四链体是由富含鸟嘌呤碱基(G)的DNA 序列形成的一种特殊的DNA二级结构[20-21],当它们与氯化血红素(Hemin)结合后,可以显现出较强的过氧化物酶活性,能够催化H2O2参与的一些反应[22-25]。目前,G-四链体-氯血红素DNA 酶用于检测的优势得到了进一步的发现和巩固,发展了多种生物传感器[26-29]。近年来,将G-四链体-氯血红素DNA 酶酶促信号放大与T-Hg2+-T特异性识别结合起来,发展了多种Hg2+检测新方法[30-32],虽然这类传感器弥补了传统仪器分析方法的不足,但仍然存在信号放大方法单一、灵敏度不足等问题,在生物医学样品分析方面难以实现超灵敏Hg2+检测。

目前广泛用于提高生物传感器灵敏度的核酸分子扩增技术主要包括环介导等温扩增、滚环扩增、链置换扩增、聚合酶链式反应以及连接酶链式反应等[33-35],但这些技术依赖于DNA模板扩增,而扩增的模板序列增加了交叉污染的可能性,因此该类方法容易出现假阳性结果。杂交链式反应是2个DNA发夹之间的自组装杂交反应,在引发DNA存在时,通过部分互补序列重叠成一个长的双链DNA纳米线(纳米线定义为一种具有在横向上被限制在100纳米以下(纵向没有限制)的一维结构,DNA双螺旋结构的直径为2 nm)。由于不需要扩增DNA模板、信号放大不需要酶参与、假阳性率低等特点,该方法已经与多种技术相结合用于发展新型、高效生物传感器,如电化学方法测定核酸[36]、生物发光方法测定核酸[37]、荧光方法测定核酸[38]、G-四链体-血红素DNA酶纳米线测定核酸[27]、G-四链体-血红素DNA酶纳米线测定脂多糖[39]等技术,而且杂交链式反应还可以进一步应用于分子生物学、DNA诊断和临床诊断。

本研究以聚苯乙烯微球为纳米线自组装界面,通过T-Hg2+-T特异性识别结构引发杂交链式反应,在微球界面上自行组装具有串联排列分子间裂分 G-四链体-血红素DNA酶的DNA纳米线,发展高灵敏的Hg2+“Turn on”检测生物传感器。该技术具有检测灵敏度高,特异性好的特点,操作简单,可用于现场检测技术的发展。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

UV-1800紫外-可见分光光度计(日本岛津仪器公司),手提式压力蒸汽灭菌器(浙江新丰区医疗器械有限公司),真空干燥箱(北京市永光明医疗仪器有限公司),电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司),高速离心机(艾本德生命科学公司),超纯水器(德国默克密理博公司),pH酸度计(杭州陆恒生物科技有限公司)。链霉亲和素功能化的聚苯乙烯微球(直径15.4 μm)购自美国Bangs Lab公司,氯化血红素(Hemin)、2,2′-联氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二甲亚砜(DMSO)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、HgCl2、Pb(NO)2、CdCl2、FeCl2及其他金属离子均购自上海生工生物工程股份有限公司;牛血清白蛋白(BSA)购自上海华蓝化学科技有限公司。DNA探针(表1)购自上海生工生物工程股份有限公司,并经HPLC纯化。

表1 DNA探针序列

1.2 实验过程

1.2.1 微球修饰

取100 μL链霉亲和素修饰的微球(直径为15.4 μm)于0.5 mL的灭菌离心管中,用100 μL的亲和洗脱液(pH 7.5,20 mmol/L Tris-HCl,1 M NaCl,1 mmol/L EDTA,0.0005% Triton X-100)洗涤两次,3 500 r/min离心分离后去上层清液。向微球中加入47 μL的亲和洗脱液以及3 μL的Hg2+捕获探针(10μM),混合均匀并37 ℃摇床孵育1 h。通过离心洗涤除去未结合的探针,加入100 μL亲和洗脱液于4 ℃下保存备用。

1.2.2 汞离子比色分析

发夹探针P1和发夹探针P2分别加热到95 ℃孵育,5 min后再缓慢(2 h内)冷却到室温以保证发夹结构的形成,使用前保存在4 ℃。移取5 μL功能化微球于灭菌离心管中,加入10 μL发夹探针P1和发夹探针P2的混合溶液(0.5 μmol/L),10 μL不同浓度的Hg2+,再加入160 μL 10 mmol/L HEPES buffer(pH 7.0,包含100 mmol/L NaNO3,25 mmol/L KNO3),37 ℃摇床孵育50 min。离心去上清,用HEPES buffer洗涤3次,最后加入100μL的HEPES buffer重新悬浮。加入6 μL 20 μM的hemin,避光下37 ℃孵育20 min,离心并用10 mmol/L HEPES buffer洗涤3次,除去多余的hemin。最后加入50 μL ABTS(4 mmol/L),和50 μL H2O2(4 mmol/L),在37 ℃条件下反应8 min,之后离心分离,取上层清液,进行吸收检测。我们选择420 nm处的吸光度作为测量值,定义ΔA420 nm=A420 nm-A0,其中A420 nm为样品测量值,A0为Hg2+浓度为0时的背景值。

图1 自组装串联DNA酶纳米线传感器检测Hg2+原理图

2 结果与讨论

2.1 检测原理

本研究借助分子间裂分G-四链体DNA酶的催化特性,在微球上构建一种检测Hg2+的信号放大方法。首先在微球表面修饰富含T碱基的Hg2+捕获探针,其5′端带有生物素标记和C10延长链,通过生物素和链霉亲和素的特异性结合,固定到链霉亲和素修饰的微球表面。G-四链体的形成至少需要4组连续或相互靠近的GGG序列,发夹探针P1和发夹探针P2的序列一端都含有3组GGG重复序列,另一端含有一组GGG重复序列,但由于2个探针在形成茎环结构时一组GGG被包含在茎部区域,因此不能形成分子内G-四链体。检测原理如图1所示,在发夹探针P1、发夹探针P2及Hg2+存在时,Hg2+捕获探针与发夹探针P1的3′端序列杂交并形成4个T-Hg2+-T结构,并将发夹探针P1的茎部打开释放P1的5′端。发夹探针P1释放的5′端序列与发夹探针P2的5′端序列反向完全互补并打开发夹探针P2的茎部结构,发夹探针P2释放的3′端序列与发夹探针P1的3′端序列完全互补并打开发夹探针P1的茎部结构,释放其5′端序列,如此周而复始,在微球表面形成DNA纳米线。由于发夹探针P1、发夹探针P2的5′游离末端及3′游离末端都包含富G序列,而且在组装的纳米线上通过杂交链式反应相互拉近并折叠形成分子间裂分G-四链体,构建成含有串联排列DNA酶的DNA纳米线。在Hemin插入后显示出明显增强的类过氧化物酶的催化活性,该酶能催化H2O2与2,2′-联氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)之间的反应产生绿色的阳离子自由基ABTS·+,在420 nm处存在最大吸收峰,其吸光值与反应体系中汞离子浓度的存在定量关系。

2.2 实验条件的优化

为获得优化的实验结果,考察了功能化微球的使用量、Hemin浓度、修饰在微球上的Hg2+捕获探针与发夹探针P1通过T-Hg2+-T配位结合的时间和温度对Hg2+检测的影响。

2.2.1 微球用量的选择

微球为汞离子识别、杂交链式反应以及DNA酶催化反应提供了反应平台,探针功能化的微球用量决定反应体系的灵敏度。如图2(a)所示,加入反应体系的微球的量在5μL(5.06×103beads/μL)以下时,随着微球量的增加,吸光值也相应提升,表明在此范围内微球量的增加,捕获的汞离子量也增加,形成了更多的DNA酶分子;当反应体系中微球的量大于5 μL的时候,吸光度不再随微球的量增加而增加,说明体系中微球的量已达到饱和。由此可见,该检测体系中微球的最适用量为5 μL,即25.3×103beads为最合适的加入量。

2.2.2 Hemin浓度的选择

向形成串联排列G-四链体DNA纳米线溶液中加入Hemin后,Hemin会插入G-四链体形成具有过氧化物酶活性的G-四链体-氯血红素-DNA酶,但由于游离的Hemin也具有一定的过氧化物酶催化活性,所以Hemin的浓度可能会对传感器的灵敏度产生影响。结果如图2(b)所示,Hemin的最佳浓度为20 μmol/L。当Hemin的浓度在20 μmol/L以下时,信号值(ΔA420 nm)随着Hemin浓度的增加而增加;当Hemin的浓度过高时,其背景信号也相应增强,所以信号值反而随之下降。因此反应体系中Hemin的最佳浓度为20 μmol/L。

图2 Hg2+浓度响应信号(ΔA420 nm)影响因素的实验优化

2.2.3 Hg2+捕获时间和温度的选择

修饰在微球上的Hg2+捕获探针包含多个T碱基,需要Hg2+参与配位与发夹探针P1的富T序列结合,其结合效率直接影响检测的灵敏度。考察了Hg2+捕获时间为10 min～80 min时对检测性能的影响,结果如图2(c)所示,当反应时间从10 min增加到50 min时,反应体系的ΔA420 nm增加,说明随着时间的延长,G-四链体DNA酶的组装量增加,催化性能增强,反应时间达到50 min时体系的ΔA420 nm达到最大,随后并不随着时间的延长而增加,说明此时Hg2+的捕获趋于饱和,所以选择50 min作为Hg2+的捕获时间。对Hg2+捕获的最适温度进行了考察,选择的温度范围为:5 ℃～45 ℃,结果如图2(d)所示,随着反应温度的升高,反应体系ΔA420 nm相应增加,在37 ℃时达到最高,随后随着温度的升高,信号值开始下降。

图3 Hg2+检测的选择性分析

2.3 Hg2+的选择性分析

为检测传感体系对Hg2+检测的选择性,实验选择了9种常见的金属离子(Zn2+、Pb2+、Mg2+、Ni2+、Fe2+、Cd2+、Ca2+、Mn2+、Co2+)作为共存离子,并分别检验了它们对Hg2+检测的干扰程度。结果如图3所示,在最优条件下反应,未加任何离子的反应体系(空白对照)吸光值与分别加入不同干扰离子的反应体系吸光值相差不大(柱状图灰色表示),表明该生物传感器对以上9种离子并不体现出选择性;另外Hg2+与其他金属离子共存时(共存离子的浓度与汞离子的浓度之比为100∶1),向反应体系中同时加入1 nmol/L的汞离子和上述100 nmol/L其他金属共存离子,空白对照中只加入1 nmol/L的汞离子,发现各组吸光值与空白对照吸光值相差不大(柱状图白色表示),相对误差在-2.8%～1.7%之间,结果表明以上9中金属离子对汞离子的干扰性很小。同时,通过空白组也可看出,设计的生物传感器对汞离子具有高选择性。

图4 (a)Hg2+浓度在2 pmol/L～10 nmol/L范围内的 校正曲线;(b)检测Hg2+的线性范围

2.4 Hg2+的定量检测

与其他汞离子分析方法相比较,如:基于金纳米颗粒修饰的丝网印刷电极免标记检测尿液中汞离子(检出限2 500 pmol/L)[40]、电感耦合等离子体质谱检测尿液和血液中汞离子(检出限847 pmol/L)[41]、基于DNAzyme/ABTS-H2O2体系的尿液中Hg2+比色传感器(检出限2 000 pmol/L)[32]、基于核酸外切酶I辅助的尿液中Hg2+荧光传感器(检出限1 500 pmol/L)[42],本方法检测尿液中汞离子(检出限1.5 pmol/L),具有较高检测灵敏度。这主要归因于三重信号提升方式:微球反应界面导致减少的背景干扰及信号提高、杂交链式反应形成串联排列分子间裂分G-四链体-血红素DNA酶的DNA纳米线以及 G-四链体-血红素DNA酶的酶促催化信号放大。

2.5 实际样品分析

为考察该方法用于实际样品中Hg2+检测的性能,人体尿液为检测对象构建检测体系。实验采用加标法,向离心管中加入4 μL的本底尿液,然后加入不同浓度的汞离子溶液,反应溶液中的汞离子浓度分别为15 pmol/L、20 pmol/L、50 pmol/L。结果如表2所示,检测尿液样品的平均回收率为97.6%～103.7%之间,RSD在1.7%～3.1%之间;说明设计的传感器可用于尿液样本中的汞离子检测,具有较好的准确度。

表2 实际样品检测

3 结论

本研究以聚苯乙烯微球为纳米线组装界面,通过T-Hg2+-T特异性识别结构引发杂交链式反应,在微球界面上自行组装具有串联排列分子间裂分G-四链体-血红素DNA酶的DNA纳米线,发展了一种高灵敏的Hg2+“Turn on”检测生物传感器。微球的引入极大的增强了传感器的抗干扰能力,降低了背景信号,实现了人体尿液中Hg2+的快速检测。本方法操作简单、灵敏度高、特异性好,适合发展为环境监测现场实时分析技术,未来亦可能成为医学界检测汞离子的手段。