绿僵菌信息素基因（MAT1）功能研究

张二豪 赵润东 禄亚洲

摘要 以绿僵菌为试验材料，通过同源重组的方法构建信息素基因（MaMAT1）敲除和回复载体，利用农杆菌介导转化法获得MaMAT1基因敲除和回复菌株，并对ΔMaMAT1菌株孢子萌发率、产孢量、抗湿热、抗紫外及毒力进行分析。结果表明，与WT菌株相比，ΔMaMAT1菌株的萌发率、抗湿热和抗紫外能力无显著差异，但其产孢量、毒力显著降低。

关键词 蝗绿僵菌;信息素;敲除;毒力

中图分类号 S-476  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）12-0094-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.024

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Functional Study of MaMAT1 in Metarhizium acridum

ZHANG Er hao， ZHAO Run dong， LU Ya zhou

（Food Science College， Tibet Agriculture and Animal Husbandry University， Linzhi， Tibet 860000）

Abstract Using Metarhizium acridum as the experimental material， the function of MaMAT1， knock down and complementation of MaMAT1 were constructed by homologous recombination， ΔMaMAT1 and CP strains were obtained by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation， and the germination， sporulation， UV B， heat shock tolerance and virulence of MaMAT1 were analyzed. The results showed that the disruption of MaMAT1 did not affect the germination， UV B and heat shock tolerance， however， the sporulation and virulence significantly decreased compared to WT.

Key words Metarhizium acridum;MAT1;Knock down;Virulence

昆蟲病原真菌作为一类潜在生防微生物，在害虫防治过程中扮演着重要角色。截至2017年，已有200多种昆虫病原真菌被注册并用于害虫防治[1]。蝗绿僵菌（Metarhizium acridum）作为一种重要的昆虫病原真菌，在亚洲、非洲和澳洲已被广泛用于蝗虫和蚱蜢的防治[2-4]。蝗绿僵菌作为昆虫病原真菌的模式生物，其侵染致病过程具有明显的特征，即孢子萌发、菌丝发育、附着孢分化、浸染钉的形成及昆虫体内定殖[5-7]。但其较高的生产成本、较长的致死时间限制其大规模应用，因此提高昆虫病原真菌产孢量，增强毒力、缩短发酵时间成为人们研究的热点。

“信息素（荷尔蒙）”在真核生物中是远距离作用的化学物质。普遍认为“信息素”是性别因子，控制性别和形态形成[8]。真菌中，雌性或雄性菌丝产生甾醇类信息刺激雄性或雌性器官的产生[9]。在植物病原真菌Phytophthora 和 Pythium上，甾醇类信息调节有性生殖和无性生殖。如在Pythium sylvaticum上可扩散的信息分别控制异宗配合或非自我兼容的交配器官的形成[10]。信息诱导是玉米黑粉病菌（Ustilago maydis）侵染的必需阶段[11]，信息首先诱导交配型菌丝结合，然后在tubulin基因的作用下形成具有侵染性的双核菌丝，诱导细胞核的形成[12-13]。在昆虫病原真菌Lagenidium giganteum中有相类似的信息行为。在Allomyces species中，雌性和雄性孢子形成丝状结合体参与有性生殖。在Zygomycota中，大多数菌丝是异宗配合的，它们通过同宗配合和异宗配合实现有性生殖，在这一过程中信息调控了菌丝从无性到有性的转换[14-15]。在子囊菌的Neurospora crassa上也观察到了性信息的作用痕迹，但没有分离出相应的化合物[16-17]。在担子菌中，脂肽类信息参与双核的形成和子实体的发育[18]。研究者普遍意识到真菌的内源性信息和动物类信息具有同源性[9，19]。它们在真菌的生长和发育过程中扮演着重要角色[20]。

蝗绿僵菌不同产孢时期转录组分析发现信息素基因显著上调表达，而信息素（MAT）基因在绿僵菌的产孢、抗性、侵染、定殖和致病力方面的功能尚不清楚。因此探索信息基因在蝗绿僵菌产孢、抗性、侵染、定殖和致病力方面的功能，为提高蝗绿僵菌孢子生产和害虫防治提供理论依据和技术途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试蝗绿僵菌CQMa102（Metarhizium acridum102）菌株分离于被感染的竹脊飞蝗僵虫尸体上。大肠杆菌（Escherichia coli）和根癌农杆菌感受态（Agrobacterium tumefaciens）均由西藏农牧学院生物技术实验室制备。毒力生测中所用的东亚飞蝗由西藏农牧学院生物技术实验室提供，其饲养条件：光照周期16 h∶8 h（光∶暗），温度为（28±2）℃，相对湿度70%[21]。

1.2 试验方法

1.2.1 蝗绿僵菌MaMAT1基因的敲除。

提取蝗绿僵菌基因组DNA，分别扩增MaMAT1基因上游（左臂）和下游（右臂）序列，根据同源重组的原理将左右臂序列分别连接到pK2-PB敲除载体上，将构建好的载体转化至大肠杆菌感受细胞中，并涂布于LB固体培养基上（含50 μg/mL的卡那霉素），37 ℃恒温培养箱中倒置培养12 h，挑取单菌落并PCR验证，将构建好的pK2-PB-MaMAT1-L/R敲除载体转化至根癌农杆菌感受态细胞[22]，与绿僵菌共培养以获得MaMat1基因敲除菌株。

1.2.2 蝗绿僵菌孢子萌发率的测定。

取在1/4 SDA培养基上培养14 d的新鲜成熟孢子，将100 μL 1×107个/mL的孢悬液均匀涂布于1/4 SDA平板上，在28 ℃恒温培养箱中倒置培养12 h，期间每3 h观察一次，当孢子出芽长度等于或大于孢子直径50%时视为萌发，每组3次重复。计算公式：萌发率=萌发孢子总数/总孢子数×100%。

1.2.3 蝗绿僵菌产孢量的测定。

取在1/4 SDA培养基上培养14 d的新鲜成熟孢子，并配制1×107个/mL的孢悬液，取5 μL 孢悬液于含有1/4 SDA培养基的24孔板中，28 ℃倒置培养，每隔3 d观察一次，并在显微镜下统计孢子数，每组3次重复。产孢量=孢子数/孔面积。

1.2.4 蝗绿僵菌孢子抗湿热、抗紫外能力测定[21]。

（1）抗湿热能力测定。取培养14 d的新鲜成熟蝗绿僵菌孢子，取50 μL经45 ℃处理0、2、4、6、8 h浓度为1×107个/mL 的孢悬液均匀涂布于1/4 SDA固体培养基上，在28 ℃恒温培养箱中倒置培养20 h，显微镜下统计萌发孢子数，每组设3次重复。计算公式同“1.2.2”。

（2）抗紫外能力测定。取培养14 d的新鲜成熟蝗绿僵菌孢子，取100 μL浓度为1×107个/mL的孢悬液均匀涂布于1/4 SDA固体培养基上，在1 350 mW/m2紫外条件下，28 ℃倒置培养，每2 h观察一次，连续观察8 h，显微镜下统计孢子萌发率。每组设3个重复。计算公式同“1.2.2”。

1.2.5 蝗绿僵菌毒力测定[21]。

（1）体表侵染。配制1×107个/mL的石蜡油孢悬液，取5 μL孢悬液点滴于5龄东亚飞蝗幼虫的背板上，每组40头，每12 h統计一次，直至蝗虫全部死亡，蝗虫死亡率=死亡数/总头数×100%。以点滴不含孢子的石蜡油试验组为阴性对照。每组设3个重复。

（2）体内注射。配制1×106个/mL的孢子水悬液，于5龄东亚飞蝗幼虫腹部第二、三腹节处注射5 μL孢悬液，每组40头，每12 h统计一次，直至蝗虫全部死亡，蝗虫死亡率=死亡数/总头数×100%。以注射5 μL ddH2O的试验组为阴性对照组。每组设3个重复。

1.3 数据分析

用Excel 2019对试验数据进行处理，GraphPad.Prism5.02软件作图，用SPSS 20.0进行差异显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 MaMAT1基因生物信息学分析

生物信息学分析表明，MaMAT1 cDNA ORF 全长为741 bp，编码246个氨基酸。在线预测分析发现MaMAT1蛋白分子量（Mw）为28.1 kD，等电点（pI）是9.51。通过NCBI数据库找出其他7种绿僵菌MAT1蛋白序列，通过同源比对及系统发育树分析表明，蝗绿僵菌MaMAT1基因位点仅含有MAT1-2-1基因，且与大孢绿僵菌（Metarhizium majus，MAJ）MAT1-2-1基因聚为一支，其相似性高达94.72%（图1）。

2.2 MaMAT1基因敲除和回复验证

根据同源重组原理，利用根癌农杆菌介导转化法获得ΔMaMAT1和CP菌株，其载体构建原理见图2A。提取WT、ΔMaMAT1和CP菌株基因组DNA，用BfrBI和Nsp7121I限制性内切酶进行酶切并Southern blot验证（图2B），结果表明，WT和ΔMaMAT1菌株仅有一条条带，其大小分别为500和1 000 bp，而CP菌株含有2条条带（500和1 000 bp），其大小分别与WT和CP菌株一致。综上所述，该试验所获得的ΔMaMAT1和CP菌株均为阳性转化子。

2.3 MaMAT1基因对蝗绿僵菌孢子萌发率和产孢量的影响

为分析MaMAT1 基因缺失对蝗绿僵菌孢子萌发率和产孢量的影响，分别对ΔMaMAT1、WT和回复（CP）菌株的萌发率和产孢量进行研究。结果表明，MaMAT1基因缺失不影响孢子萌发率，与WT和CP菌株相比，差异不显著（图3A），但其产孢量显著低于WT和CP菌株（图3B）。综上所述，MaMAT1基因不影响蝗绿僵菌孢子萌发率，但显著影响其产孢量。

2.4 MaMAT1基因对蝗绿僵菌孢子抗湿热和抗紫外能力的影响

为分析MaMAT1对蝗绿僵菌孢子抗湿热和抗紫外能力的影响，分别对ΔMaMAT1、WT和CP菌株的抗湿热和抗紫外能力进行了研究。结果表明，与WT和CP菌株相比，ΔMaMAT1菌株抗湿热和抗紫外能力无显著差异（图4）。综上所述，MaMAT1基因的缺失不影响蝗绿僵菌的抗逆境能力。

2.5 MaMAT1基因对毒力的影响

以东亚飞蝗5龄幼虫为试验材料，采用体内注射和体表接种2种方法研究MaMAT1基因缺失对蝗绿僵菌孢子毒力的影响。点滴试验结果表明，ΔMaMAT1菌株毒力显著低于WT和CP（P<0.05），与WT相比，其半致死时间推迟了1.49 d（图5A、B）。注射试验结果表明，ΔMaMAT1菌株的毒力降低，差异显著（P<0.05），与WT相比，其半致死时间推迟了0.72 d（图5C、D）。综上所述，MaMAT1基因影响绿僵菌对体表的穿透能力和在蝗虫体内免疫应答。

3 讨论

信息素在真核生物中作为一类调节类物质，在其生长发育过程中扮演着重要角色[20]。MAT1-1和MAT1-2是控制真菌交配的关键基因，即使亲缘关系较近的物种，其MAT1-1和MAT1-2 位点所含的基因数量也不同，如罗伯茨绿僵菌、球孢白僵菌和蛹虫草[23]。生物信息学分析表明蝗绿僵菌中仅含有信息素基因MAT1-2。

研究表明，在担子菌中，信息类物质参与双核的形成和子实体的发育[18]。该试验研究表明，MaMAT1基因不影响蝗绿僵菌孢子萌发率，但其产孢量显著降低，可能是由于MaMAT1基因的缺失影响了绿僵菌孢子的发育过程。抗逆境试验分析表明，MaMAT1基因的缺失不影响绿僵菌抗湿热和抗紫外能力，说明MaMAT1基因的缺失基本不影响绿僵菌细胞壁的结构和厚度。真菌中的信息素类似于植物中的生长调节因子（生长素、赤霉素、脱落酸和乙烯），在植物病原菌赤霉菌（Gibberella fujikuroi）中，其产生赤霉素参与宿主的致病过程。白色念珠菌中信息受体系统参与了宿主的附着作用[24]。蝗绿僵菌MAT1基因的缺失导致其毒力显著降低，这与前人研究结果一致，说明MAT1基因可能参与了宿主附着作用和致病过程。

蝗绿僵菌作为一种重要昆虫病原真菌，在害虫防治方面扮演着重要角色，其产孢量和毒力是限制其大规模应用的关键因素。从该试验结果可知，MaMAT1基因参与蝗绿僵菌產孢和毒力有关。这一研究结果为提高孢子产量和毒力提供理论依据。

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