猪等孢球虫纯种株的建立及其生物学特性研究

程振扬 臧传佼 徐向东 李文静 候照峰 刘丹丹 许金俊 陶建平

摘要 从哺乳仔猪的腹泻粪样中分离出等孢球虫卵囊，感染仔猪建立球虫纯种株。通过卵囊形态结构观察与18S rRNA PCR鉴定，鉴定该球虫分离株为猪等孢球虫。将6只24日龄断奶仔猪分为2组，分别感染4×102和104个孢子化卵囊，观察仔猪的临床表现及虫株的潜伏期、显露期和卵囊产量。结果表明，感染4×102个卵囊后仔猪未出现腹泻症状，感染104个卵囊后仔猪出现腹泻且持续6 d。感染4×102个孢子化卵囊时，潜隐期为5 d，显露期为7 d，每个卵囊产出5.72×103个卵囊;感染104个孢子化卵囊时，潜隐期为5 d，显露期18 d，每个卵囊产出6.41×102个卵囊。由此可见，该株猪等孢球虫对仔猪具有致病性，可用于构建猪等孢球虫病动物模型及其疾病学研究。

关键词 仔猪;猪等孢球虫;纯种株;生物学特性

中图分类号 S852.7文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）05-0095-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.026

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishment of Pure Strains of Isospora suis and Their Biological Characteristics Research

CHENG Zhen-yang， ZANG Chuan-jiao， XU Xiang-dong et al

（College of Veterinary Medicine / Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou University， Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract Oocysts of Isospora spp. were isolated from the feces of suckling piglets with diarrhea to infect piglet. A pure strain of Isospora spp.was established. Through the morphological observation of oocysts and PCR identification of 18S rRNA， the isolated strain was identified as Isospora suis.Six 24-day-old weaned piglets were divided into two groups randomly， and infected with 4×102 and 104 sporulated oocysts， respectively.Then the clinical manifestations， the prepatent and patent period， and oocyst output were observed. The results showed that no diarrhea symptom was observed in the piglets infected with 4×102 oocysts， diarrhea symptom was observed in the piglets infected with 104 oocysts and lasted for 6 days. After the piglets were infected with 4×102 sporulated oocysts，the prepatent and patent period were 5 and 7 days respectively， each oocyst produced 5.72×103 oocysts. After the piglets were infected with 104 oocysts， the prepatent and patent period were 5 and 18 days respectively，and each oocyst produced 6.41×102 oocysts. Therefore， this strain of Isospora suis had pathogenicity to piglets， and it could be used to establish the animal models of coccidiosis and the study of porcine coccidiosis.

Key words Piglet;Isospora suis;Pure strains;Biological characteristics

猪球虫病主要是由等孢属（Isospora）和艾美耳属（Eimeria）的球虫寄生于猪消化道引起的一种寄生性原虫病[1]。据文献记载，猪球虫有16种，其中猪等孢球虫（Isospora suis）致病力最强，是哺乳期仔猪球虫病的主要病原，可引起仔豬食欲减少、严重腹泻、消瘦等，其发病率高达80%，呈世界性分布，给养猪业造成巨大的经济损失[2-4]。目前，该病的防治主要依赖于药物[5]。在评价药物对猪球虫病的防治效果时，需要利用猪等孢球虫感染仔猪，建立动物感染模型。因此，建立猪等孢球虫虫株及猪等孢球虫病模型是评价药物对猪球虫病防治效果的基础，也是进一步开展猪等孢球虫生物学、疫苗学和疾病诊断的基础。笔者通过卵囊分离、形态学观察及PCR鉴定，建立了猪等孢球虫的纯种株，并通过人工感染仔猪试验，研究猪等孢球虫田间分离株的致病性及其排卵囊规律等。

1 材料与方法

1.1 试验动物

21日龄断奶仔猪，体重5～7 kg，购自扬州某养猪场。试验前，仔猪粪便用饱和糖盐水漂浮法检查有无球虫卵囊，连续检查3 d，同时观察仔猪的精神状态、食欲以及粪便形状等。选择体质健壮、粪检球虫卵囊呈阴性的仔猪用于试验。仔猪饲养在经5%氨水和高锰酸钾消毒2次的猪舍与笼子中，料槽、水槽、集粪盘等用具均用沸水冲洗消毒。仔猪定时喂食，自由饮水。

1.2 粪样采集、卵囊分离与培养

扬州仪征市某猪场12日龄仔猪发生腹泻，取新鲜腹泻物置于塑料袋，放入低温保存箱中运回实验室。粪样采用饱和盐水漂浮法检查，球虫卵囊呈阳性者，其全部粪样加入4～5倍清水及少量乙醚溶液后搅拌均匀，分别经60目和260目锦纶筛过滤，所得滤液经3 000 r/min离心8 min，弃上层液，往沉淀物中加入清水后搅拌均匀，3 000 r/min离心8 min，重复2次。往沉淀物中加入10倍体积的饱和糖盐水（饱和食盐水溶液与饱和蔗糖溶液的体积比为1∶1），搅拌均匀后3 000 r/min离心10 min，卵囊漂浮于液面。用胶头滴管吸取上层漂浮物并置于20倍体积的清水中，3 000 r/min离心8 min，弃上清后加清水，搅拌均匀后再次离心（3 000 r/min，8 min）。重复3次。将沉淀物放入250 mL锥形瓶内，加入终浓度2.5%的重铬酸钾溶液，搅拌均匀后置于27 ℃恒温培养箱中培养7 d。在培养过程中每天搅动培养液数次，同时用显微镜观察球虫卵囊孢子化情况。当90%卵囊完全孢子化时，收集卵囊置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.3 纯种卵囊的分离与增殖

参照戴亚斌等[6]的方法分离等孢球虫卵囊，分别感染2头仔猪，每头感染100个孢子化卵囊。感染后第6～12天收集仔猪排出的全部粪便，按“1.2”方法分离卵囊并进行孢子化培养。

1.4 球虫种类的形态学鉴定

取孢子化培养后的卵囊液制片，分别在10×40和 10×100倍的正置式生物显微镜下仔细观察每个卵囊的形态与结构，测量卵囊和孢子囊的大小，对照参考文献和图谱进行种类鉴定[1，7]。

1.5 球虫种类的PCR鉴定

1.5.1 球虫卵囊纯化与总DNA提取。

参照藏传佼[2]的方法纯化卵囊。将纯化的卵囊经电动组织研磨器破碎后，参照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit试剂盒操作指南提取卵囊总DNA。

1.5.2 猪等孢球虫18S rRNA序列的PCR扩增。

参照藏传佼[2 ]设计引物，由华大科技有限公司合成，引物序列如下：

18S-F为TGTTTATTAGATACAGAACCAACCCAC，18S-R为CTTTCTATGTCTGGACCTGGTGAG。

PCR反应体系（25 μL）如下：ddH 2O 9.5 μL，18S-F（10 μmol/L）和18S-R（10 μmol/L）各1.0 μL，Premix Taq 12.5 μL，DNA模板（135 ng/μL）1.0 μL。PCR反应条件如下：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物进行1.0% TAE琼脂糖凝胶电泳检测。预期扩增片段长度为1 030 bp。同时，以刚第弓形虫（Toxoplasma gondii）速殖子和猪艾美耳球虫（Eimeria spp.）卵囊的DNA模板为对照，这2种DNA模板均由笔者所在实验室提供。

1.6 人工感染试验

1.6.1 试验分组与感染。

将6只24日龄断奶仔猪分成A、B 2组，每组3头。A组为低剂量组，每头感染4×102个孢子化卵囊;B组为高剂量组，每头感染104个孢子化卵囊。借助于开口器与胃导管，将卵囊一次灌胃。

1.6.2 临床观察。

每天观察3次并记录仔猪的一般临床体征，如饮食、精神状态、粪便颜色与形状等。每天清洗笼具、食槽和集粪板，防止继发感染。

1.6.3 卵囊检查。

感染后第4天开始用饱和糖盐水漂浮法检查粪便。每隔12 h检查1次，发现卵囊后，每天收集仔猪全天排出的粪便，采用麦克马斯特氏法[8]计算每克粪便中的卵囊数（oocyst per gram，OPG），然后计算出每天排出的卵囊总数，直至排卵囊结束，连续2 d粪检未见卵囊则试验结束。

2 结果与分析

2.1 球虫卵囊形态学观察结果

卵囊呈球形或亚球形，囊壁光滑且薄，无卵膜孔，平均大小为19.3（17.8～24.0）μm×17.6（14.7～21.9）μm。孢子化卵囊有2个孢子囊，无极粒与卵囊余体。孢子囊呈椭圆形或圆形，有呈颗粒状的孢子囊余体，无斯氏体，平均大小为13.9（10.5～15.9）μm×10.4（7.6～11.8）μm。每个孢子囊内含有4个子孢子，子孢子呈腊肠形或香蕉形（图1）。

2.2 纯种卵囊分离与增殖结果

仔猪感染卵囊后第6天采用饱和糖盐水漂浮法检查其排出的粪便，發现少量卵囊。随后收集至感染后第10天的全部粪便，用“1.2”的方法分离卵囊，培养至孢子化。显微镜下观察收集的孢子化卵囊，可见卵囊大小较为一致，卵囊结构与“2.1”中描述一致，表明猪等孢球虫纯种株成功建立并得以增殖。

2.3 球虫种类的PCR鉴定结果

以提取的卵囊DNA为模板，成功扩增出1 030 bp左右的条带，与预期条带大小相符。用刚第弓形虫和猪艾美耳球虫的DNA模板未扩增出条带（图2）。PCR鉴定结果进一步验证此次建立的球虫纯种株为猪等孢球虫。

2.4 临床观察

在整个试验期间，全部仔猪精神、食欲、饮水均正常。A组（低剂量）仔猪排出的粪便外观正常（图3a），B组（高剂量）仔猪在感染后第6天排出灰土色的稀粪（图3b），至第12天粪便形状恢复正常。

2.5 卵囊产量、潜隐期与显露期

猪等孢球虫感染仔猪后的潜隐期、显露期及其排卵囊规律见图4。仔猪感染孢子化卵囊后第6天粪检均可见卵囊，潜隐期为5 d。感染4×102个卵囊的仔猪第7天产出卵囊数达到高峰，每头猪排出15.2×105个卵囊;随后卵囊排出数迅速减少，第11天粪检未见卵囊，其显露期为5 d;每头猪产出卵囊数共22.89×105个，每个卵囊产出5.72×103个卵囊。感染104个卵囊仔猪，感染后第8天排卵囊达到高峰，每头猪排出20×105个卵囊;随后卵囊排出数显著减少，但在第12天和第19天排出卵囊数又略有增加，第23天粪检未见卵囊，其显露期为17 d;每头猪产出卵囊数共64.10×105个，每个卵囊产出6.41×102个卵囊。

3 讨论

迄今为止，文献记载的猪球虫有16种，在分类上隶属艾美耳科（Eimeriidae）艾美耳属和等孢属，在等孢属仅有猪等孢球虫一个种[1-2]。艾美耳属球虫孢子化卵囊有4个孢子囊，每个孢子囊中有2个子孢子;等孢属球虫孢子化卵囊有2个孢子囊，每个孢子囊中有4个子孢子[1]。因此，依据孢子化卵囊的形态结构易于鉴别猪等孢球虫。猪等孢球虫对哺乳仔猪有易感性，主要引起仔猪腹泻。该研究采集腹泻仔猪的粪便进行粪检，在腹泻物中可见呈球形或亚球形的卵囊，卵囊孢子化培养后见其含2个孢子囊，每个孢子囊中有4个子孢子。随后分离纯种卵囊并用其感染仔猪、增殖卵囊，对增殖后的卵囊进行PCR鉴定，进一步鉴定该株球虫为猪等孢球虫。

猪人工感染试验显示，该猪等孢球虫纯种株的潜隐期为5 d，显露期分别为5 d（感染4×102个卵囊）和17 d（感染104个卵囊），其显露期随感染剂量的增加而显著延长。藏传佼[2]报道24日龄断奶仔猪感染 4×102个孢子化卵囊时，潜隐期为5 d，显露期为7 d;感染104个孢子化卵囊时，潜隐期为5 d，显露期达18 d。刘光辉等[9]报道3日龄仔猪感染30个猪等孢球虫孢子化卵囊的潜隐期为7～9 d，显露期为15～18 d;感染2 000个猪等孢球虫孢子化卵囊的潜隐期为4～6 d，显露期为7～13 d。究其原因，可能与感染猪的日龄、虫株以及感染剂量有关。该试验结果也显示，猪排出的卵囊总量随感染剂量的增加而增加，但每个卵囊的产卵囊数则有所下降，这与汪飞燕等[10]的报道相一致，可能是因“拥挤”效应所致。

猪等孢球虫对不同日龄的猪均有易感性，3周龄内的哺乳仔猪感染后可引发疾病，主要临床症状为腹泻，病猪衰弱、脱水、发育迟缓，成年猪多为带虫者[11]。用于该试验的猪是24日龄断奶仔猪，感染4×102个卵囊后未出现腹泻症状，感染104个卵囊后出现腹泻且持续6 d，表明该猪等孢球虫虫株对仔猪具有致病性，可用于构建猪等孢球虫病动物模型，同时也暗示保育猪和育肥猪在感染大量猪等孢球虫时也会引发疾病。笔者发现哺乳仔猪粪便中含有大量的脂肪，用常规方法分离与收集猪等孢球虫卵囊较为困难，而断奶仔猪粪便中脂肪含量低、且粗纤维含量较高，卵囊分离较容易且孢子化率高。因此，笔者建议在进行猪等孢球虫卵囊传代增殖时，可选择断奶仔猪作为试验动物。

参考文献

[1] 杨光友.兽医寄生虫病学[M].北京：中国农业出版社，2017.

[2] 臧传佼.猪等孢球虫的分离鉴定及其防治药物的效力试验[D].扬州：扬州大学，2015.

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[4] 刘光辉，程俊贞，宁长申.河南省猪等孢球虫的分子变异规律研究[J].安徽农业科学，2017，45（11）：93-95.

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[7] 符敖齐，林孟初，陶建平，等.江苏丹阳等县猪球虫调查报告[J].江苏农学院学报，1986，7（2）：39-42.

[8] 索勋，李国清.鸡球虫病学[M].北京：中国农业大学出版社，1998.

[9] 刘光辉，宁长申，张龙现，等.猪等孢球虫纯种卵囊扩增及生物学特性研究[J].河南农业大学学报，2005，39（4）：410-416.

[10] 汪飞燕，闫欣，刘悦，等.不同感染剂量对毒害艾美耳球虫繁殖力的影响[J].中国家禽，2019，41（1）：62-64.

[11] MUNDT H C，JOACHIM A，DAUGSCHIES A，et al.Population biology studies on Isospora suis in piglets[J].Parasitol Res，2003，90（S3）：158-159.