低温乙醇法在猪血浆白蛋白提取中的适用性研究

龚慧芳 张淇美 唐青海 阳希 杨海

摘要 [目的]探索猪血浆白蛋白的高效提取方法。[方法]对低温乙醇法在猪血浆白蛋白提取中的适用性进行了研究，设定猪血浆白蛋白提取步骤，并对离心速度、反应时间、pH、适用温度4个关键参数进行优化，对目标蛋白进行定性定量分析。[结果]低温乙醇法适合提取猪血浆白蛋白，最佳提取条件为离心速度8 000 r/min，反应时间90 min，pH 4.7，温度-8 ℃;采用改良后的低温乙醇法，1 L猪血浆可提取白蛋白29.3 g，产品纯度为97.3%，提取时长约10 h。[结论]改良后的低温乙醇法是一种高效提取猪血浆白蛋白的可靠方法。

关键词 猪血浆;白蛋白;提取;低温乙醇法;优化

中图分类号 TS 251.93文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）05-0172-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.048

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research on the Applicability of Low Temperature Ethanol Method in the Extraction of Porcine Plasma Albumin

GONG Hui-fang， ZHANG Qi-mei， TANG Qing-hai et al

（Key Laboratory of Conservation and Utilization of Biological Resources in Nanyue Mountain Area， Hengyang Normal University， Hengyang， Hunan 421008）

Abstract [Objective] To explore an efficient method to extract porcine plasma albumin. [Method] The applicability of low temperature ethanol method in the extraction of porcine plasma albumin was studied， and the four key parameters， centrifugal speed， reaction time， pH and suitable temperature， were optimized;the target protein was analyzed qualitatively and quantitatively. [Result] The results showed that low temperature ethanol method was suitable for the extraction of porcine plasma albumin. The optimum centrifugation speed was 8 000 r/min， the reaction time was 90 min， the pH was 4.7， and the temperature was -8℃;the improved low temperature ethanol method could extract 29.3 g albumin from 1 L pig plasma， the purity of the product was 97.3%， and the extraction time was about 10 h. [Conclusion] The improved low temperature ethanol method is a reliable and efficient method for the extraction of porcine plasma albumin.

Key words Porcine plasma;Albumin;Extraction;Low temperature ethanol method;Optimization

隨着养猪业的迅猛发展，猪血等副产品产量急剧增加。据统计，2018年我国猪血产量接近200万t，其中被收集利用的不到50%[1]。如何充分利用猪血资源开发高附加值产品，是摆在科研人员面前的现实课题[2]。

血液占活猪体重的3%～5%，主要由血浆和血细胞组成，其中血浆占血液总体积的55%，蛋白质约占血浆总质量的6.0%～7.5%。猪血浆含有丰富的纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、凝血因子等活性蛋白，是极具开发价值和开发潜力的稀有蛋白[3]。因此，从猪血中提取各种活性蛋白，是生物药物行业的现实需求。

随着血液蛋白提取技术的日益成熟，大量具有生物活性的血浆源蛋白被提取出来，并最终形成高附加值的医疗产品，极大地促进了疾病治疗和生物产业的发展[4]。血浆中的白蛋白因在血液循环、渗透压维持、解毒、脂类代谢以及物质运输、抗氧化等方面发挥着非常重要的生理功能，已在医疗领域得到广泛应用[5-6]。血浆白蛋白临床用量的不断增加以及血源短缺，血浆白蛋白供不应求，需大量进口以弥补市场需求。据统计，2013、2014、2015、2016、2017年我国进口人血白蛋白分别占白蛋白签发总量的46.39%、57.79%、55.59%、58.76%和 59.83%。因猪与人类之间的基因相似度达83%，且饲养管理与疾病预防控制水平日趋成熟，使得从猪血浆中提取白蛋白并加改造修饰以替代人血浆白蛋白具有较大的可能[7]。学者对人血浆白蛋白提取研究与应用一直没有停步[8-9]，盐析法、利凡诺法、热乙醇法等多种提取方法先后建立并被应用，但产品品质不高、操作复杂、成本过高、耗时过长、对环境及设备要求严苛以及有害物残留等不足也逐渐呈现，这些问题阻碍了血浆白蛋白产业的发展[10]。

为开发猪血浆白蛋白资源，笔者对低温乙醇法的适用性进行了研究，并确定了离心速度、反应时间、pH、适用温度等猪血浆白蛋白提取关键参数，旨在为猪血浆白蛋白的规模化制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料血浆

猪血浆由南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室制备，具体方法为：采集新鲜猪血，按照9∶1的比例添加3.8%（M/V）的柠檬酸三钠，搅拌均匀，进行抗凝处理。抗凝血液于4 ℃、1 000 r/min离心30 min，获取上清液，再于4 ℃、3 000 r/min离心30 min，再次获取上清液。反复数次，直至得到清亮的血浆。离心所得血浆分装后，-20 ℃储藏备用。

1.2 主要试剂

无水乙醇购自湖南汇虹试剂有限公司，柠檬酸三钠、丙烯酰胺、过硫酸铵、异丙醇、甘油、TEMED、2-ME等购自上海易恩公司，标准酪蛋白购自Sigma公司，甲双叉丙烯酰胺、蛋白Mark、SDS购自北京Slarbio公司，溴麝香草酚蓝购自上海瑞永公司。

1.3 主要仪器

低温离心机，Eppendorf;低温恒温槽，江苏恒诺仪器制造有限公司;可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司;电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司;pH计，优特仪器有限公司;凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司;蛋白超滤系统，美国PALL公司;全自动电泳仪，美国海伦娜公司。

1.4 试验方法

1.4.1 猪血浆蛋白含量的测定。采用双缩脲法测定猪血浆蛋白浓度，各成分配比见表1。具体操作为：将血浆与试剂按表1配比混匀，37 ℃水浴20 min后冷却至室温，在紫外分光光度计波长540 nm处进行吸光度值检测，换算得浓度数据。

1.4.2

猪血浆白蛋白的初步分离。①用0.9% 的NaCl溶液稀释血浆至蛋白含量5%左右，用1 mol/L的柠檬酸调pH至6.5～6.8，降温至（1.0±0.5）℃，缓慢加入-15 ℃、95%的乙醇（按每1 000 mL血浆制品加267 mL 95%乙醇计算，并控制乙醇终浓度为20%），边加入边搅拌，加完后复调pH至6.5～6.8。待温度至-4.5～-5.0 ℃时开始离心，离心温度控制在-3.0～-5.0 ℃，离心至上清液澄清，去沉淀，取上清液备用。②取上清液，用1 mol/L的醋酸缓冲液调pH至6.5～6.8，缓慢加入95%的冰乙醇，边加入边搅拌，控制最终乙醇浓度为40%左右，加完后复调pH至6.5～6.8，整个反应温度控制在-4.2～-5.0 ℃，离心至上清液澄清，弃沉淀，收集上清液。③取上清液，用2 mol/L的醋酸溶液调节pH至4.7～4.8，在低温条件下（-5.0～-7.0 ℃）离心至上清液澄清，取沉淀，沉淀即为血浆白蛋白。

1.4.3 猪血浆白蛋白纯化及过滤。配制沉淀量5倍的8.5%乙醇溶液作為溶解液，温度控制为3.0～5.0 ℃。白蛋白沉淀称重后放入溶解液中，搅拌至沉淀完全溶解，此时反应温度控制在-3.0～-3.5 ℃。待沉淀完全溶解后，用除菌滤膜过滤至滤液澄清，压滤不超过0.2 MPa。

用1 mol/L碳酸氢钠调节pH至6.8～7.1，中空纤维超滤脱醇，浓缩蛋白浓度至10%～13%，采用9倍纯水连续等体积透析，使蛋白终浓度为20%，按1 g蛋白质加入0.165 mmol 辛酸钠，并用1 mol/L碳酸氢钠调节pH至6.8～7.2后进行过滤除菌，将成品进行分装、低温冻存。

1.4.4

猪血浆白蛋白的定性定量鉴定。采用SDS-PAGE法测定猪血浆白蛋白分子量，具体操作如下：采用5%浓缩胶、10%分离胶，依次上样后，上层80 V电泳30 min，下层120 V电泳60 min，用凝胶成像系统对SDS-PAGE 电泳结果进行图谱分析。

取0.1 g冻干后的粗蛋白沉淀，充分溶于100 mL的纯净水中，利用全自动电泳分析仪完成蛋白定量检测，直接获取蛋白纯度和含量数据。

1.4.5 数据统计分析方法。采用SPSS 15.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 白蛋白的定性定量检测

SDS-PAGE电泳图谱分析结果见图1。由图1可见，提取产物在6.64 kD处出现标志性条带，与猪血白蛋白标准品条带大小一致。全自动电泳分析仪获得扫描图像（图2），结果显示，猪血浆白蛋白峰单一且集中，说明提取的蛋白纯度较高。

2.2 离心速度对猪血浆白蛋白提取结果的影响

由检测结果可知，离心速度对猪血浆白蛋白得率和纯度存在显著影响，具体见表2。

由表2可知，离心速度在8 000 r/min时，目标蛋白的得率和纯度显著高于6 000和10 000 r/min，说明8 000 r/min的离心速度适合猪血浆白蛋白的提取。

2.3 反应时间对猪血浆白蛋白提取结果的影响

检测结果表明，反应时间对猪血浆白蛋白的提取纯度存在显著影响（表3）。

由表3可知，乙醇与血浆蛋白作用时间为120 min时，蛋白得率和蛋白纯度最高，但与作用90 min时没有显著差异，为节约时间、提高提取效率，反应时间采用90 min。

2.4 pH对猪血浆白蛋白提取结果的影响

由表4可知，当环境pH为4.7时，目标蛋白的得率和纯度最高，且显著高于pH为4.0和5.4时的得率和纯度。

2.5 反应温度对猪血浆白蛋白提取结果的影响

结果见表5。由表5可知，温度为-8 ℃时，目标蛋白的得率和纯度显著高于-4和-12 ℃，说明提取猪血浆白蛋白的适宜温度为-8 ℃。

3 结论与讨论

由于猪的遗传背景、器官大小、形态和功能与人有着高度的相似性，故猪血液制品在医疗领域的应用越来越受到广泛关注，特别是现在白蛋白在医疗方面的广泛应用以及人血的供应不足，导致对猪血白蛋白替代人血白蛋白的研究越来越引起学者的关注[11]。猪血白蛋白替代人血白蛋白的首要问题是从猪血浆中获得高质量的白蛋白。

低温乙醇法是人血浆白蛋白提取的常规方法[9]，其基本原理是低浓度血浆在低温下加入乙醇，通过降低血浆中水分子的活度来降低溶液的介电常数，使蛋白分子间通过极性基团的相互作用，在范德华力的作用下发生凝聚而沉淀[12]。白蛋白作为血浆主要成分中分子量最小的一种，往往在最后一步的沉淀反应中才能分离出来，因此开展低温乙醇法在猪血浆白蛋白提取中的适用性研究，探索并确定离心速度、反应时间、pH、适用温度4个关键参数对于获得高纯度猪血浆白蛋白具有十分重要的意义。

①基于低温乙醇法，试验对猪血浆白蛋白的提取关键要素进行了优化，结果表明，离心速度在8 000 r/min时，白蛋白得率和纯度分别为29.1%和97.0%，显著高于6 000和10 000 r/min时的得率和纯度，说明8 000 r/min的离心速度适合猪血浆白蛋白的分离。离心速度的选择取决于血浆内的蛋白成分和目的蛋白的分子量大小，由于猪血浆内充斥着大量脂蛋白，如果离心速度过慢，高密度脂蛋白就不能完全与上清分离，导致蛋白得率和纯度下降;如果离心速度过快，溶液中的小分子白蛋白分离不出来，导致白蛋白含量降低，影响下一步提取操作。②保障乙醇与血浆的反应时间（作用时间），主要是为了保障乙醇与血浆中的蛋白成分充分接触，以充分渗透并影响蛋白分子排列。在实际操作中，如果反应时间太长，提取效率则会降低;如果反应时间太短，则产品纯度和得率难以得到保障。该研究结果表明，作用时间在90 min时，即可达到乙醇充分渗透的效果，且与作用时间为120 min时的得率和纯度无显著差异。③不同的蛋白有不同的等电点，pH主要是通过影响蛋白分子的微环境，调节蛋白质的溶解状态，从而达到促进蛋白沉淀的目的。由于蛋白质是两性电解质，因此蛋白提取过程中的pH控制非常重要。白蛋白含有19個负电荷，等电点在pH 4.0～5.5，该研究结果表明，pH为4.7较好地促进了白蛋白沉淀，达到了预期效果。④沉淀反应在低温下进行，主要是降低蛋白溶液中的各分子运动，防止蛋白因乙醇作用而变性。温度过低，蛋白得率则显著下降[10];温度过高，则会使蛋白变性，失去提取意义。该试验结果表明，猪血浆白蛋白提取的适宜温度是-8 ℃。

此外，蛋白初始浓度对猪血浆白蛋白提取也有重要影响[13]。蛋白初始浓度过高，加入乙醇后大量蛋白发生沉淀，随着提取过程的深入，目的蛋白得率和纯度也会有所降低;蛋白初始浓度过低，蛋白跟水分子析出的时间延长，提取效率也会降低。因此，每一阶段的反应都必须严格控制蛋白的浓度，当离心速度、反应时间、pH、反应温度和乙醇添加量都一致的情况下，低温乙醇法提取效果的高低取决于蛋白分子的浓度。在参考同行的基础上，该研究采用5%的蛋白初始浓度，取得了较好的试验效果。

笔者对低温乙醇法在猪血浆白蛋白提取中的适用性进行了研究，探索并确立了低温乙醇法提取猪血浆白蛋白的4个关键参数，可为猪血浆白蛋白的规模化制备和相关研究提供参考。

参考文献

[1] 张莺莺，王洪洋，涂尾龙，等.食用猪血产品质量安全控制的关键问题及解决办法[J].上海农业科技，2019（3）：24-27.

[2] 王赟，李爱彬，陈湘来，等.猪血的开发和利用[J].食品与机械，2012，28（1）：272-274.

[3] 邱玉华.猪血的综合利用研究[J].科技创新导报，2008（33）：228.

[4] GRAZZINI G，MANNUCCI P M，OLEARI F.Plasma-derived medicinal products：Demand and clinical use[J] Blood transfusion，2013，11（S4）：S2-S5.

[5] 杜彬荣.药用人血浆蛋白制备的研究进展[J].医药导报，2015，34（1）：81-83.

[6] 李茜茜，霍记平，赵志刚.国内外血液制品上市情况及其临床应用[J].临床药物治疗杂志，2020，18（1）：1-6.

[7] 李尚，石岗，冯韶华，等.CRISPR/Cas9 系统在猪基因编辑中的研究进展[J].中国畜牧杂志，2019，55（12）：27-32.

[8] RAOUFINIA R，MOTA A，NOZARI S，et al.A methodological approach for purification and characterization of human serum albumin[J].Journal of immunoassay immunochem，2016，37（6）：623-635.

[9] RAOUFINIA R，BALKANI S，KEYHANVAR N，et al.Human albumin purification：A modified and concise method[J].Journal of immunoassay immunochem，2018，39（6）：687-695.

[10] 姜恒，韩威，刘彦华，等.热乙醇法提取猪血白蛋白工艺改良的探讨[J].西南国防医药，2011，21（11）：1167-1169.

[11] 余谦，王勇，钱小红，等.一种转基因猪血中重组人血清白蛋白分离纯化新方法[J].分析测试学报，2019，38（5）：539-545.

[12] 王鸣宇，王斐，臧恒昌，等.人血白蛋白生产及其应用研究进展[J].药学研究，2014，33（10）：600-602.

[13] 魏国宏，韩祥东，张齐明，等.血浆蛋白含量对低温乙醇工艺蛋白收率的影响[J].甘肃医药，2019，38（7）：593-595.