超高效液相色谱-串联质谱法测定白酒中10种甜味剂

郑小玲 唐柏彬 李贤良 王国民 莫敏 张舸 胡鑫 李建平 郗存显

摘要 [目的]建立同时检测白酒中糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、新橙皮苷二氢查尔酮、爱德万甜、甘素10种甜味剂的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定方法。[方法]采用C 18色谱柱，乙腈∶2 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）水溶液梯度洗脱，超高效液相色谱-串联质谱在负离子模式下进行检测。[结果]10种甜味剂在0.02～1.00 mg/L线性关系良好，决定系数R2≥0.999 1。方法的检出限LOD （S/N=3）在0.30～6.00 μg/L，定量限LOQ （S/N=10）在1.00～20.00 μg/L。在0.10、0.20、0.50 mg/L的加标水平下，回收率在87.8%～102.9%，RSD为0.8%～3.3%（n=6）。[结论]该方法前处理简单、重现性好、灵敏度高、准确可靠、分析速度快，适用于白酒中10种甜味剂的准确定量分析。

关键词 白酒;甜味剂;超高效液相色谱-串联质谱法

中图分类号 TS 261.7文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）05-0192-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.054

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of 10 Sweeterners in White Spirits by Ultra-performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHENG Xiao-ling，TANG Bo-bin，LI Xian-liang et al

（Chongqing Customs Technology Center，Chongqing 400020）

Abstract [Objective]A method was established for the simultaneous determination of saccharin sodium，cyclamate，acesulfame，sucralose，aspartame，allitame，neohesperidin dihydrochalcone，edutame and glycine 10 sweeteners in white spirits by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS） in white spirits.[Method]C 18 column was used with gradient elution of acetonitrile-2 mmol/L ammonium acetate （containing 0.1% formic acid） in aqueous solution，and HPLC-MS/MS was used for detection in negative ion mode.[Result] The calibration curves of 10 sweeteners were a linear in the range 0.02-1.00 mg/L，and the determination coefficient R2 was more than 0.999 1.The detection limit LOD （S/N=3） was 0.30-6.00 μg/L，and the LOQ （S/N=10） was 1.00-20.00 μg/L.Under the spiked levels of 0.10，0.20 and 0.50 mg/L，the recoveries were 87.8%-102.9%，and the relative standard deviations were between 0.8%-3.3% （n=6）.[Conclusion]The method has the advantages of simple pretreatment，good reproducibility，high sensitivity，accuracy and reliability，and is suitable for the accurate quantitative analysis of 10 sweeteners in white spirits.

Key words White spirits;Sweeteners;Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）

目前食品中經常使用的甜味剂包括糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜等[1-2]。一些不法生产者为了降低成本、增加口感，向白酒中非法添加甜味剂[3-4]，在日常的检测中已发现有白酒中添加甜蜜素、阿斯巴甜、纽甜的情况，也有多种合成甜味剂混合使用的情况。已有的检测标准有GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》、GB 5009.247—2016《食品安全国家标准 食品中纽甜的测定》、GB 5009.28—2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》、GB 5009.97—2016《食品安全国家标准 食品中环己基氨基磺酸钠的测定》、GB 22255—2014《食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》、GB 5009.263—2016 《食品安全国家标准 食品中阿斯巴甜和阿力甜的测定》、SN/T 3538—2013 《出口食品中六种合成甜味剂的检测方法：液相色谱-质谱/质谱法》等[5-11]。

针对合成甜味剂的检测方法，已报道的有高效液相色谱-紫外分光光度法、高效液相色谱-蒸发光散射法、薄层色谱法、离子色谱法、气相色谱法、高效液相色谱-质谱法等[12-21]。其中高效液相色谱-紫外分光光度法较为常用，主要检测的甜味剂有安赛蜜和糖精钠，但由于受到紫外分光光度法灵敏度的限制，部分甜味剂可能因含量较低而不能检出，而且该方法不能提供结构信息，在实际样品分析时容易受到基质干扰而产生假阳性现象。高效液相色谱-蒸发光散射法检测甜味剂，检测灵敏度不高，对酒中低含量的甜味剂不能检出。气相色谱法检测甜味剂需要衍生化，操作烦琐。近年来，采用高效液相色谱-质谱法对食品中的甜味剂进行分析已有一些报道，但是这些方法尚存在分析种类少、消耗时间长、分离度差等不足。该研究建立一种同时检测酒类产品中糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、新橙皮苷二氢查尔酮、爱德万甜和甘素10种甜味剂的超高效液相色谱-串联质谱检测技术，以期为白酒市场监管提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 白酒样品购买于重庆本地市场。甲醇（色谱纯），德国Merck公司;乙腈（色谱纯），德国Meker公司;乙酸铵（分析纯，纯度99%），重庆市川东化工有限公司;甲酸（优级纯，纯度98%），重庆市川东化工有限公司;乙醇（优级纯，纯度99%）， 重庆市川东化工有限公司。标准品：甜蜜素（CAS：139-05-9）、糖精钠（CAS：82385-42-0）、安赛蜜（CAS：55589-62-3）、三氯蔗糖（CAS：56038-13-2）、阿斯巴甜（CAS：22839-47-0）、阿力甜（CAS：99016-42-9）、纽甜（CAS：165450-17-9）、新橙皮苷二氢查尔酮（CAS：20702-77-6）、爱德万甜（CAS：714229-20-6）和甘素（CAS：150-69-6），均购自美国ChromaDex公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-质谱联用仪API 5500 QTRAP，美國AB SCIEX公司;有机滤膜（孔径0.22 μm），天津津腾实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制。

1.3.1.1 单标储备液。分别准确称取糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、新橙皮苷二氢查尔酮、爱德万甜和甘素标准品10 mg于10 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度线，配制成浓度为1.00 mg/mL的单标储备溶液，于4 ℃冰箱中保存待用。

1.3.1.2 中间储备液。准确量取各个单标储备液各100 μL于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度线并混匀，制得10 mg/L 的混合标准溶液作为中间储备液，于4 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2 标准使用溶液的配制。将混合标准溶液（10 mg/L）用空白基质溶液稀释至0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的标准系列溶液。

1.3.3 样品前处理。

将白酒用超纯水稀释5倍，将稀释后的样品用0.22 μm的水系滤膜过滤，供超高效液相色谱-质谱联用仪分析。

1.3.4 液相色谱条件。

Acquity UPLC BEH C 18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流动相：A为乙腈，B为2 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）水溶液，梯度洗脱程序见表1;柱温40 ℃，进样量5 μL，流速0.3 mL/min。

1.3.5 质谱条件。

电离装置为电喷雾（ESI）负离子模式;监测模式为多反应监测模式（MRM）;扫描间隔时间50 ms;电喷雾电压（IS）为-4 500 V;离子源温度（TEM）为500.0 ℃;碰撞气压力（CAD）为68.95 kPa;气帘气压力（CUR）为344.74 kPa;雾化器压力（GS1）为344.74 kPa;辅助气压力（GS2）为344.74 kPa;定性离子对、定量离子对、去簇电压（DP）、碰撞室入口电压（EP）、碰撞电压（CE）和碰撞室出口电压（CXP）见表2。

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化

为了消除乙醇基质干扰，通常采用氮吹法、旋转蒸发法和加水稀释法。氮吹法、旋转蒸发法用时较长，而该试验研究的是快速检测方法，故考察了加水稀释法。通过对样品的稀释，达到减弱基质干扰，降低乙醇对色谱峰峰型的影响，提高方法的准确性与重现性。体积分数2%、5%、10%、20%、40%、60%乙醇溶液在相同检测条件下，比较10种甜味剂200 μg/L的加标回收试验，重复试验3次，计算平均值。结果表明乙醇体积分数为2%、5%和10%时，10种甜味剂的平均回收率达到最高点且基本一致，考虑到样品的稀释倍数太大会降低方法的检出限，所以选择体积分数10%为最佳体积分数。白酒的酒精度一般在50%左右，即将样品用超纯水稀释5倍，用0.22 μm的水系滤膜过滤，供超高效液相色谱-质谱联用仪分析。

2.2 液相色谱条件优化

2.2.1 流动相的选择。

以C 18色谱柱为分离柱，在其他分离条件相同的情况下，流动相体系有机相考察了甲醇与乙腈，水相考察了2 mmol/L乙酸铵水溶液与2 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）水溶液。由于乙腈极性比甲醇大，溶解能力好，能够使峰型更对称，尖锐。同时，在流动相中加入少量的甲酸溶液有助于准分子离子的形成，增加响应值，所以选用乙腈-2 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）水溶液体系作为流动相进行梯度洗脱，不仅能够将杂峰与甜味剂有效分离，而且使目标物响应更好，灵敏度更高。

2.2.2 洗脱梯度。

以乙腈为有机相、2 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）水溶液为水相进行梯度洗脱，甘素、安赛蜜、糖精钠和甜蜜素4种甜味剂出峰时间较早，在水相体积比较大时即可出峰，而其他6种甜味剂需大量有机相的洗脱才能够达到很好的分离效果并且出峰。最佳流动相洗脱梯度见表1，10种甜味剂都能够达到良好的分离效果，且峰型与响应良好。最佳洗脱梯度所对应的色谱图见图1。

2.2.3 色谱和质谱参数。该研究采用BEH C 18色谱柱，根据检测物的响应值与峰型，对色谱参数进行优化调整，优化后的参数为柱温40 ℃、进样量5 μL、流速0.3 mL/min。在优化后的质谱条件下进行检测，结果表明（图1），10种甜味剂在负离子模式下均获得丰富的碎片离子，响应值与灵敏度都表现良好，目标物的信号与离子丰度较强。

2.3 线性范围和检出限

配制浓度为0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L系列10种甜味剂的混合标准溶液进样检测，得到标准曲线回归方程，见表3，线性范围为0.02～1.00 mg/L，决定系数R2≥0.999 1，检出限LOD （S/N=3）在0.30～6.00 μg/L，定量限LOQ （S/N=10）在1.00～20.00 μg/L。

2.4 精密度与回收率 在不含分析物本底的白酒中添加不同水平的甜味剂混合标准溶液，分别添加不同浓度水平（0.1、0.2、0.5 mg/L），每个添加水平做5组平行样品，用超高效液相色谱-串联质谱法检测，计算其回收率和精密度。从表4可以看出，10种甜味剂的平均回收率为87.8%～102.9%，RSD為0.8%～3.3%（n=6），表明该方法具有较好的回收率，可以满足日常检测要求。

2.5 样品测定

从当地市场随机抽取10组白酒样品，采用该方法对10组样品进行目标物检测，6号和8号白酒样品中检测出糖精钠，4号和8号白酒样品中检测出甜蜜素，6号白酒样品中检测出阿斯巴甜，2号白酒样品中检测出纽甜，具体样品检测结果见表5。

3 结论

该研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时检测白酒中10种甜味剂（糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、新橙皮苷二氢查尔酮、爱德万甜和甘素）的检测方法。10种甜味剂在质量浓度为0.02～1.00 mg/L有良好的线性关系，决定系数R2≥0.999 1，该方法的检出限LOD （S/N=3）在0.30～6.00 μg/L，定量限LOQ （S/N=10）在1.00～20.00 μg/L，在0.1、0.2、0.5 mg/L的加标水平下，回收率在87.8%～102.9%，RSD在0.8%～3.3%。检测方法前处理简单、重现性好、灵敏度高、准确可靠、分析速度快，可用于白酒中多种合成甜味剂的快速检测。对于保障白酒的饮用安全和保护消费者健康有重要意义，为白酒市场监管提供有力的技术支持。

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