耐低温降解纤维素菌株的筛选及复合菌系构建

路垚 刘雅辉 孙建平 何宗均 赵琳娜 戴相林 赵子婧

摘要 [目的]筛选适合我国北方冬春季秸秆降解的高效低温纤维素降解菌株。[方法]在低溫地区采集土壤，10 ℃初筛耐低温菌株，通过刚果红染色液法进行复筛，利用DNS法测定CMC酶活性。将筛得菌株和实验室自存菌株结合拮抗试验构建复合菌系，测定复合菌系CMC酶活性，测定秸秆降解率，并对代表性菌株进行产酶条件优化，对最终确定的复合菌系中的菌株进行分子生物学鉴定。[结果]10 ℃低温培养初筛得到55株耐低温菌株，刚果红染色法复筛得到8株具有明显水解圈的单菌株，其中包括细菌3株、真菌2株、放线菌3株，其中纤维素酶活性最高达到47.0 U/mL;根据拮抗试验构建了2个复合菌系，其纤维素酶活性分别达到31.0和53.0 U/mL;秸秆降解试验中，实验室和沙袋法的复合菌系2对秸秆的降解率分别达31.8%和45.1%，显著高于复合菌系1和对照组;对JGDZTX3进行产酶条件优化，确定最佳氮源为牛肉膏，培养温度为10 ℃，培养时间为4 d，初始pH为7，在此条件下CMC酶活性达到66.5 U/mL，这4个条件对产酶均有显著影响（P<0.05）;对复合菌系2的4个未知菌株进行鉴定，鉴定结果分别为白蚁菌、葡萄球菌、长柄木霉、芬莱氏链霉菌。[结论]通过该试验筛选得到的耐低温可降解纤维素复合菌系有较强的纤维素分解能力，在北方低温地区有良好的应用前景。

关键词 纤维素降解菌;复合菌系;低温;纤维素酶;筛选;菌株鉴定

中图分类号 S182  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）10-0006-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.002

Screening of Low Temperature Cellulose Degradation Strains and Construction of Complex Microbial System

LU Yao1，LIU Ya-hui2，SUN Jian-ping2 et al

（1.Institute of Agricultural Resources and Environment Sciences，Tianjin Academy of Agricultural Sciences，Tianjin 300384;2.Institute of Coastal Agriculture， Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Tangshan，Hebei 063299）

Abstract [Objective] In order to screen the high efficiency low temperature cellulose degradation strains suitable for winter and spring straw degradation in north China. [Method]Soil samples were collected in low temperature area， low temperature strains were screened at 10 ℃， the isolated strains were screened by Congo red staining solution， and CMC enzyme activity was determined by DNS method. The complex microbial system was constructed by combining the screened strain and the laboratory self-existing strain with antagonistic test. CMC enzyme activity of the complex microbial system was determined， and the straw degradation rate was determined. The enzyme production conditions of the representative strain was optimized， and the strains in the final determined complex microbial system were identified by molecular biology. [Result]A total of 55 low temperature strains were obtained by initial screening at 10 ℃， and 8 strains were obtained by Congo red staining after screening， including 3 strains of bacteria， 2 strains of fungi and 3 strains of actinomycetes with obvious hydrolytic circles. The highest cellulase activity reached 47.0 U/mL. According to the antagonistic test， the cellulase activity of two complex microbial systems reached 31.0 and 53.0 U/mL， respectively. In the straw degradation test， the degradation rates of the compound strain 2 in the laboratory and the sandbag method were 31.8% and 45.1%， respectively， which were significantly higher than those of the compound strain 1 and the control group.The optimum conditions for JGDZTX3 enzyme production were optimized， and the optimal nitrogen source was beef paste， culture temperature was 10 ℃， culture time was 4 d， and initial pH was 7. Under the optimum conditions， CMC enzyme activity reached 66.5 U/mL ，all the four conditions had significant effects on enzyme production （P< 0.05）.The four unknown strains of the complex microbial system were identified， and the identification results were Isoptericola sp.， Staphylococcus sp.， Trichoderma longibrachiatum and Streptomyces finlayi.[Conclusion]The low temperature cellulose-degradable complex microbial system screened by this experiment has strong cellulose-decomposing ability， and has a good application prospect in the low temperature area of north China.

Key words Cellulose degradation strains;Complex microbial system;Low temperature;Cellulase;Screening;Strain identification

基金项目 河北省省级科技计划项目（19227307D）;天津市农业科技成果转化与推广项目（201701090）。

作者简介 路垚（1989—），女，山东临沂人，助理研究员，硕士，从事农业微生物研究。通信作者，副研究员，从事农业微生物研究。

收稿日期 2021-12-06;修回日期 2022-01-18

我国有大量秸秆，每年各类秸秆产生量高达8 亿t，如果能合理利用，将会是很重要的生物资源[1-2]。秸秆的资源化处理有多种方式，其中微生物降解的方法具有安全性高、能耗低等优点被广泛应用[3]。但是自然条件下土壤中纤维素分解菌的数量较少，降解效率低，秸秆直接还田后不能被快速分解，因此通常人工添加一些纤维素分解菌加快秸秆的腐解[4-5]。已发现的纤维素分解菌有很多种，涵盖了细菌、真菌、放线菌等各类菌株[6]，国内外也有很多人在自然界中进行了纤维素分解菌菌株的筛选和应用。

郑丽等[7]在木薯生境里分离筛选得到57株纤维素分解菌株;姜立春等[8]从绵阳湿地朽木和土样中，筛选得到28株产纤维素酶的细菌菌株;赵旭等[9]在土壤中筛选的Penicillium sp.D5菌株，以玉米秸秆为碳源发酵10 d，可使玉米秸秆减重29.8%;Selvam等[10]研究表明纤维素降解是菌株间相互协同作用产生的结果;王天生等[11]研究发现复合菌系的纤维素分解能力好于单一菌株;王垚等[12]研究表明 H57.1 和 H08.1菌株复合后具有较高的秸秆分解能力，其秸秆降解率可达到55.7%。

微生物降解受环境影响较大，很多纤维素分解菌在低温环境下不能生长代谢，不能正常发挥降解作用。我国北方地区冬春季温度低，常温条件下筛选的纤维素分解菌难以发挥作用。目前，对纤维素分解菌的研究主要集中在常温环境的筛选，对低温环境下纤维素分解菌的研究相对较少[13-14]。该研究通过从河北滨海区低温土壤中分离筛选纤维素酶活性较高的菌株，构建复合菌系，以期为北方低温地区秸秆的资源化利用提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 样品和培养基

1.1.1 样品来源。

河北省唐山市曹妃甸区河北省农林科学院研究基地土样，分别为水稻田秸秆还田2年土、水稻田秸秆还田3年土、水稻秸秆还田咸水土、秸秆堆置土。存放于自封袋中，封口，于4 ℃保存备用。

1.1.2 培养基。

（1）CMC分离培养基。CMC-Na 10 g，（NH4）2SO4 4 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO4 1 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

（2）种子培养基。（NH4）2SO4 3.0 g，KH2PO4 1.0 g，FeSO4·7H2O 5.0 mg，MnSO4·H2O 1.6 mg，CaCl2 0.1 g，ZnSO4·7H2O 1.7 mg，MgSO4·7H2O 0.5 g，CoCl2 2.0 mg，NaCl 0.1 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

（3）牛肉膏蛋白胨培养基。牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

（4）PDA培养基。马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，H2O 1 000 mL，pH自然。

（5）高氏一号培养基。可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，NaCl 0.5 g，琼脂 20 g，H2O 1 000 mL，pH 7.4～7.6。

（6）秸秆降解培养基。秸秆3 g，CMC-Na 10 g，（NH4）2SO4 4 g，K2HPO4 1 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，KH2PO4 1 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.2 菌株分离筛选

1.2.1 菌株的初筛。

将采集到的土壤样品用无菌水制成10-4、10-5、10-6稀释度的菌悬液，在CMC培养基上涂布，放置生化培养箱10 ℃培养5 d。将初筛得到的菌株在固体平板上分别编号，并分别划线纯化，然后每个平板倒入15 mL刚果红溶液（1 mL/mg）染色30 min，用1 mol/L氯化鈉溶液脱色2～3次，只保留有透明圈的对应标号菌株，将得到的细菌保存至牛肉膏蛋白胨试管斜面培养基，真菌保存至 PDA 试管斜面培养基，放线菌存放至高氏一号试管斜面培养基，放置 4 ℃冰箱保存。

1.2.2 菌株的复筛。

将保存的菌株接种于CMC培养基，放至摇床10 ℃恒温振荡培养5 d，在CMC固体平板上放置牛津杯，在牛津杯中加入100  μL菌液，10 ℃恒温培养箱培养5 d，取出牛津杯，测量菌落直径（d），每个平板倒入15 mL 刚果红溶液（1 mL/mg）染色30 min，然后用 1 mol/L氯化钠溶液清洗脱色 2～3次，测量透明圈的直径（D），每个菌株做3个重复。

1.3 DNS法测定酶活

1.3.1 原样酶液的制备。

将待测菌株接种到种子培养基，10 ℃恒温振荡培养3 d，转接至CMC分离培养基培养5 d，取菌液10 mL，3 000 r/min离心10 min，离心后的上清液即为原样酶液，供测试用。

1.3.2 测定步骤。

每个样品取2支大试管，1支作为空白对照。样品管中加1.0 mL原样酶液，然后2支试管中分别加入4.0 mL已预热至60 ℃的CMC缓冲液，在60 ℃的水浴锅中反应20 min取出，每管立即加入3.0 mL DNS显色液，摇匀后在对照管中再加入1.0 mL原样酶液。将2支试管放入沸水浴中，显色5 min后立即取出，流水冷却，用分光光度计于490 nm处测其OD值，与标准葡萄糖曲线对照，计算出样品和对照的葡萄糖量，通过公式计算酶活性：U=k（m1-m0）/20，式中，U为样品的酶活，1个酶活单位代表1 mL原样酶液1 min产生1 μg葡萄糖;k为样品稀释倍数;m1为样品葡萄糖量;m0为对照葡萄糖量;20为酶与底物反应时间。

1.4 耐低温复合菌系的构建

将筛选得到的菌株与天津市农业科学院农业资源与环境研究所土壤微生物研究室自存可低温降解纤维素的菌株（枯草芽孢杆菌KC、胶胨样芽孢杆菌GSY），根据细菌、真菌、放线菌的合理搭配以及各菌株间的拮抗作用，构建2组复合菌系。

1.5 实验室秸秆降解率测定

在250 mL三角瓶中加入90 mL秸秆降解培养基，玉米秸秆的处理方法为粉碎过40目筛，50 ℃烘干至恒重，灭菌后，2个试验组每个三角瓶中加入10 mL复合菌剂，对照组加入10 mL灭菌蒸馏水，10 ℃恒温振荡培养，15 d后用滤纸过滤收集秸秆，用蒸馏水清洗3次，80 ℃烘干至恒重，计算失重率，每个处理设置3次重复。

1.6 沙袋法秸秆降解率测定

试验在2019年11—12月进行，开始前先称取3份1 kg的秸秆，切割成3～5 cm 段状，85 ℃烘干至恒重并称量记录。称取1 kg秸秆，切割成3～5 cm 段状，试验组加入10 mL复合菌剂混合均匀，对照组加入10 mL灭菌蒸馏水，装入长110 cm、宽60 cm、孔径为0.18 mm的尼龙袋中，埋入土壤25～35 cm的土层中，温度6～10 ℃，60 d后取出尼龙袋，用自来水将秸秆冲洗干净，然后85 ℃烘干至恒重并称量记录。计算失重率，每个处理设置3次重复。

1.7 菌株的产酶条件优化

选取最具代表性的菌株，即纤维素酶活性最高的菌株，将菌株以接种量10%接种到种子培养基中，分别设置不同的氮源（硫酸铵、酵母膏、牛肉膏）、不同的培养温度（4、10、15、20、30 ℃）、不同的培养时间（2、3、4、5 d）、不同的初始pH（6、7、8），测定菌株的CMC酶活性，以确定菌株最佳的产酶条件。在最佳产酶条件下进行优化试验，测定菌株CMC酶活性。

1.8 菌株的分子生物学鉴定

将秸秆降解效果较好的复合菌剂的各菌株进行分子生物学的鉴定。鉴定方法为用引物27F/1492R或ITS1/ITS4进行PCR 扩增，然后将PCR 产物切胶纯化回收，用引物27F/1492R 或ITS1/ITS4 测序，将测序结果序列在NCBI 上Blast 比对完成菌种鉴定。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的筛选

初步筛选得到可以10 ℃低温生长的菌株55株，进一步通过透明圈在秸秆堆置土中筛选得到低温纤维素降解细菌3株、低温纤维素降解真菌2株，水稻田秸秆还田土中筛选得到低温纤维素降解放线菌3株。3株细菌分别编号JGDZTX1、JGDZTX2、JGDZTX3，2株真菌分别编号JGDZTZ2、JGDZTZ3，3株放线菌分别编号SDT2NF1、SDT2NF2、SDT2NF3。

2.2 透明圈直径

3株细菌和3株放线菌均测得透明圈直径，2株真菌因长得过大，未测出透明圈直径。透明圈结果见表1和图1。

从表1可以看出，JGDZTX2的透明圈直径最大，达5.27 cm，JGDZTX1、JGDZTX2、JGDZTX3、SDT2NF2、SDT2NF3的D/d值均大于2.00，均具有较强的纤维素分解能力。

2.3 CMC酶活性

对JGDZTX1、JGDZTX2、JGDZTX3、JGDZTZ2、JGDZTZ3、SDT2NF1、SDT2NF2和SDT2NF3共8株筛选菌株进行CMC酶活性测定，结果发现，其CMC酶活性分别为17.5、31.5、47.0、34.0、13.5、4.0、2.0、33.0 U/mL。其中JGDZTX2、JGDZTX3、JGDZTZ2、SDT2NF3的CMC酶活性均大于30.0 U/mL，有较好的纤维素分解能力。实验室自存菌株枯草芽孢杆菌（KC）、胶胨样芽孢杆菌（GSY）的CMC酶活性分别为28.0、25.0 U/mL。

2.4 复合菌系构建

综合考虑筛选得到的8株菌的CMC酶活性和拮抗作用（表2），将这8个菌株分为2组，分别与天津市农业科学院农业资源与环境研究所土壤微生物研究室自存的2株菌株混合，構建2组复合菌系。各菌株均按照菌∶锆石=1∶2的比例吸附于锆石上。其中复合菌系1的复合方法为JGDZTX1∶JGDZTZ3∶SDT2NF1∶SDT2NF2∶KC∶GSY=3∶3∶3∶3∶2∶1，复合菌系2的复合方法为JGDZTX3∶JGDZTZ2∶SDT2NF3∶JGDZTX2∶KC∶GSY=3∶3∶3∶3∶2∶1。2组复合菌系的CMC酶活性分别达到31.0和53.0 U/mL，均高于单一菌CMC酶活性。

2.5 实验室秸秆降解率测定

为了得到秸秆降解能力强的复合菌系，进一步在实验室培养条件下测定了2组复合菌系对秸秆的降解率。由图2可知，复合菌系1对秸秆的降解率为24.4%，复合菌系2对秸秆的降解率为31.8%，与空白对照相比，2个复合菌系在低温条件下的秸秆降解率均显著高于对照（P<0.05），2个复合菌系相比于对照组的增幅分别达264.18%和374.63%;复合菌系2的降解率也显著高于复合菌系1。说明2组复合菌系对秸秆的降解能力都较强，并且复合菌系2的降解效果更好。

2.6 沙袋法秸秆降解率测定

为了更接近于田间应用效果，通过沙袋法模拟田间试验条件，测定2组复合菌系对秸秆的降解率。由图3可知，复合菌系1对秸秆的降解率为28.7%，复合菌系2对秸秆的降解率为45.1%，空白对照组虽然没有添加菌剂，但是土壤环境中也存在纤维素分解菌，会有一定的秸秆降解作用，秸秆降解率为22.6%。2个复合菌系的秸秆降解率均显著高于对照（P<0.05），2个复合菌系相比于对照组的增幅分别达26.99%和99.56%;复合菌系2的降解率也显著高于复合菌系1。说明2组复合菌系对秸秆的降解能力都较强，并且复合菌系2的降解效果更好。该试验结果与实验室秸秆降解试验结果相一致，复合菌系2的秸秆降解能

力更强。

2.7 菌株的产酶条件优化

筛选菌株中JGDZTX3的CMC酶活性最强，以JGDZTX3为代表进行产酶条件优化，通过试验可以看出不同氮源、温度、培养时间、pH对该菌株产酶均具有较大影响，结果如图4所示。

在不同氮源的试验中，设置培养温度为10 ℃，培养时间为3 d，初始pH为7，结果显示，以牛肉膏作为唯一氮源时CMC酶活性最高，可达到58.5 U/mL，该试验条件下CMC酶活性显著高于硫酸铵和酵母膏。

在不同温度的试验中，设置氮源为硫酸铵3 g和酵母膏1 g，培养时间为3 d，初始pH为7，结果显示，随着温度升高CMC酶活性呈现出先增后降的趋势，温度为10 ℃时CMC酶活性达到最大值（56.5 U/mL），该温度下CMC酶活性显著高于其他温度水平。

在不同培养时间的试验中，设置氮源为硫酸铵3 g和酵母膏1 g，培养温度为10 ℃，初始pH为7，結果显示，随着培养天数增加CMC酶活性呈现逐渐增高后趋于平稳的趋势，2～3 d的增长较快，3～4 d的增长较缓，4 d时CMC酶活性达到最大值（52.6 U/mL），该时间下CMC酶活性显著高于2 d和3 d时的值。

在不同初始pH的试验中，设置氮源为硫酸铵3 g和酵母膏1 g，培养温度为10 ℃，培养时间为3 d，结果显示，随着pH增加CMC酶活性呈现出先增后降的趋势，pH为7时CMC酶活性达到最大值（48.5 U/mL），该pH水平下CMC酶活性显著高于其他pH水平。

综上所述，通过单因素试验确定了最佳氮源为牛肉膏，最适培养温度为10 ℃，最佳培养时间为4 d，最佳初始pH为7。以此条件对菌株JGDZTX3进行了一次优化培养，得到CMC酶活性为66.5 U/mL。

2.8 菌株的鉴定

通过前面试验，复合菌剂2的实验室秸秆降解效果和沙袋法秸秆降解效果均较好，因此对复合菌系2中未知的4个菌株进行分子生物学鉴定。鉴定结果（表3）显示，JGDZTX2是葡萄球菌（Staphylococcus sp.），JGDZTX3是白蚁菌（Isoptericola sp.），JGDZTZ2是长柄木霉（Trichoderma longibrachiatum），SDT2NF3是芬莱氏链霉菌（Streptomyces finlayi）。

3 讨论与结论

利用纤维素降解微生物处理秸秆是一种安全高效的秸秆资源化处理方式[15]。杨娜等[16]从自然发酵堆肥中筛选得到一株高效降解纤维素的菌株SC2，其滤纸酶活性为17.70 U/mL，对玉米秸秆的降解率可达到33.07%。孟建宇等[17]从内蒙古西部地区筛选得到23株常温纤维素降解菌，纤维素酶活性在4～88 U/mL。这些筛选得到的常温菌株均有较强的纤维素分解能力，但是在低温环境下就很难发挥作用。我国北方地区冬春季温度低，低温纤维素分解菌将有更广的适用范围。然而，目前国内外的研究多集中在常温菌株，对于土壤中低温纤维素降解菌的研究很少[18]，且低温筛选的条件一般是在15 ℃以上，不适用于北方冬春季10 ℃以下的土壤环境。张必周等[19]为筛选低温菌株，在15 ℃下筛选得到11株具有纤维素分解能力的菌株。黄亚丽等[20]为了筛选适用于黄淮海北部秋冬季节的菌株，在16 ℃下进行了秸秆降解真菌的筛选，筛选得到一株长枝木霉，接种45 d的秸秆降解率可达到56.73%。以上筛选出的低温菌株，在15 ℃左右可以发挥出较好的降解能力，但不一定能适用于更低的温度条件。该研究在10 ℃条件下筛选得到55株耐低温菌株，进一步从中筛选出8株有明显透明圈的菌株并测定了纤维素酶活性，最高可达47.0 U/mL，所有的培养条件均是在10 ℃进行，保证了所筛菌株在10 ℃条件下具有较强的CMC酶活性，能够在低温环境发挥较好的秸秆降解效果。

单一菌株的纤维素酶也相对单一，多种纤维素分解菌株复配在一起，纤维素酶也相对丰富，并且菌株之间协同作用有利于纤维素酶活性的提高[21-22]。该研究筛选出8株低温纤维素降解菌株，加上实验室自存的2株纤维素降解菌株，共同进行复配。第一组为JGDZTX1（17.5 U/mL）、JGDZTZ3（13.5 U/mL）、SDT2NF1（4.0 U/mL）、SDT2NF2（2.0 U/mL）、KC（28.0 U/mL）、GSY（25.0 U/mL），复合菌剂的CMC酶活性为31.0 U/mL;第二组为JGDZTX3（47.0 U/mL）、JGDZTZ2（34.0 U/mL）、SDT2NF3（33.0 U/mL）、JGDZTX2（31.5 U/mL）、KC（28.0 U/mL）、GSY（25.0 U/mL），复合菌剂的CMC酶活性为53.0 U/mL。此次试验中复合菌剂CMC酶活性均高于单一菌株，说明没有拮抗作用的纤维素分解菌菌株复配后，有助于CMC酶活性的提高。

菌株在生长代谢过程中会产生一些具有特定作用的代谢产物，在不同的生长条件刺激下，代谢产物的量会有较大差异。为了获得需要的特定产物，要对菌株的生长条件进行优化。邢慧珍等[14]筛选出一株纤维素降解的真菌，并进行了产酶条件优化，证明接种量、初始pH、培养温度菌对产酶量具有显著影响。孟建宇等[17]筛选了59株纤维素分解细菌，并对代表性菌株进行了产酶条件优化，结果表明培养温度、氮源、培养时间和初始pH均对菌株产酶有显著影响。此次试验中，共筛选出包括高效低温纤维素分解菌8株，包括细菌3株、真菌2株、放线菌3株，其中CMC酶活性最高的菌株为JGDZTX3，酶活达到47.0 U/mL。对该菌株进行产酶条件优化，测定了不同氮源、不同培养温度、不同培养时间、不同初始pH对其产酶量的影响，最终确定最佳氮源为牛肉膏，培养温度为10 ℃，培养时间为4 d，初始pH为7，试验证明这4个条件对产酶均有显著影响（P<0.05），在最佳产酶条件下CMC酶活性值达到66.5 U/mL。

综上所述，该研究在河北滨海区低温土壤中筛选出低温纤维素分解菌，并与实验室自存菌株进行复配，最终得到了一组复合菌剂，具有较高的CMC酶活性，并已在实验室秸秆降解试验和低温田间试验中，证明其具有高效加快秸秆腐解的作用，为北方低温地区秸秆的资源化利用提供了菌种来源。但是由于微生物是活体，菌株发挥作用受到多方面条件的制约，作用效果不稳定，在提高纤维素分解菌对秸秆降解的稳定性方面还有待进一步深入研究。

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