白桦酯醇对白桦悬浮细胞生长生理的影响

王勃 姜洋 詹亚光 范桂枝

摘要 以白桦悬浮细胞为试材，将0.1～5.0 μmol/L白桦酯醇添加到培养7 d的白桦细胞悬浮培养体系中处理12 h～14 d，采用比色法分析白桦悬浮细胞活力、丙二醛和NO含量等，解析白桦酯醇对白桦悬浮细胞生长生理的影响。结果表明，不同浓度白桦酯醇处理12 h～14 d，白桦悬浮细胞鲜重、活力、pH和电导率与同期对照相比无显著差异，其最大值分别在处理后14 d、7 d、14 d和12 h;与同期对照相比，白桦酯醇处理后白桦悬浮细胞中MDA含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性及其基因表达水平基本呈增加趋势，在处理14 d时达最大值;除1.0和5.0 μmol/L白桦酯醇处理显著增加了白桦悬浮细胞中NO含量外，其他处理下NO和亚硝基硫醇含量与对照相比未产生显著影响。可见0.1～5.0 μmol/L白桦酯醇对白桦悬浮细胞生长未产生显著影响。

关键词 白桦酯醇;白桦悬浮细胞;细胞活性;生长生理

中图分类号 S718  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）10-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.001

Effects of Betulin on Suspension Cell Growth Physiology of Betula platyphylla

WANG Bo，JIANG Yang，ZHAN Ya-guang et al （College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract With birch suspension cells used as testing materials，betulin of 0.1-5.0 μmol/L was added into the culture system of suspension cells of Betula platyphylla for culturing 7 d to the treatment which lasted 12 h-14 d.Colorimetric method was applied to analyzing the cell viability，malondialdehyde and NO content of the suspension cells of Betula platyphylla，etc.，which helped to dissect and analyze the effects of betulin on the growth and physiology of suspension cells of Betula platyphylla.The results showed that after treatment with different concentrations of betulin for 12 h to 14 d，there was no significant difference in fresh weight，viability，pH and electrical conductivity of the suspension cells of Betula platyphylla compared with the control in the same period，and the maximum values were at 14 d，7 d，14 d and 12 h after treatment，respectively.Compared with the control in the same period，the MDA content，superoxide dismutase activity，peroxidase activity and gene expression levels in the suspension cells of Betula platyphylla after betulin alcohol treatment basically showed an increasing trend，and reached the maximum value at 14 days of treatment.Except for the treatment of 1.0 and 5.0 μmol/L betulin significantly increased the NO content in the suspension cells of Betula platyphylla，the content of NO and nitrosothiol under other treatments had no significant effect compared with the control.It could be seen that 0.1-5.0 μmol/L betulin had no significant effect on the growth of the suspension cells of Betula platyphylla.

Key words Betulin;Suspension cells of Betula platyphylla;Cell viability; Growth physiology

基金項目 黑龙江省自然科学基金项目（C2016005）;国家自然科学基金面上项目（32171829）。

作者简介 王勃（1995—），女，内蒙古赤峰人，硕士研究生，研究方向：森林生物工程。通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事植物细胞工程相关研究。

收稿日期 2021-11-16

萜类、酚类和含氮化合物等次生代谢物是由生物产生的非细胞生命活动或生物正常生长发育所必需的小分子化合物，它的合成和分布一般具有种属、组织部位和生长发育时期的特异性[1]。植物产生的次生代谢物是其长期适应生存环境中与生物或非生物因素相互作用的结果，它被人类开发用于食品加工、医药、农药和化工等领域[2]。目前对植物次生代谢物生物合成、运输和累积的研究发现，植物细胞能够产生多样的特异性代谢产物，并能够将其中一些代谢产物在细胞中积累至极高的浓度，如在专门的细胞类型中积累，或者将其螯合在细胞的液泡中[3-4]。然而，植物细胞中产生的次生代谢物对细胞自身的生长和生理等功能有何影响还不清楚。

白桦酯醇为羽扇豆烷型结构的三萜类化合物，它主要存在于酸枣仁、天门冬、石榴树皮和叶、白桦树皮和叶、罗勒、柿蒂和大枣等植物中，特别是在白桦树皮中含量高达132.45～257.11 mg/g[5]。东北林业大学森林生物工程实验室建立了产白桦酯醇的白桦悬浮细胞培养体系，但其含量仅为白桦树皮中的1%左右[6]。同时研究发现，真菌诱导子、水杨酸、NO和多胺等生物或非生物诱导子均可以显著提高白桦悬浮细胞中白桦酯醇等三萜物质的累积，含量由约1.0 mg/g提高到约20 mg/g，同时发现NO是介导上述诱导子促进白桦酯醇等三萜物质合成的一种重要信号分子[7-12]。因此，笔者以白桦悬浮细胞作为研究试材，研究外施白桦酯醇对白桦悬浮细胞生长和生理的影响，以期为解析次生代谢物对细胞自身的生长和生理功能等影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白桦悬浮细胞，白桦（Betula platyphylla Suk.）组培苗茎段诱导获得白桦愈伤组织，将愈伤组织接种于B5液体培养基中获得白桦悬浮细胞，每7 d继代一次。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理。

试验共设5个处理，即白桦酯醇浓度分别为0（对照）、0.1、0.5、1.0、5.0 μmol/L。供试白桦悬浮细胞在无菌条件下培养7 d，向培养基中加入白桦酯醇，分别处理12 h、7 d和14 d。每个处理使用3瓶细胞，每组中每个处理重复3次。

1.2.2 pH和电导率测定。

收集白桦悬浮细胞后置于50 mL离心管中，3 000 r/min离心5 min，取上清液。分别利用pH计和电导率仪进行测定。

1.2.3 细胞活力测定。参照氯化三苯四氮唑（TTC）法[13]，精确称取0.20 g白桦悬浮细胞后，加入2.5 mL磷酸缓冲液和2.5 mL 0.4% TTC后室温暗处理14 h，去上清后用5 mL蒸馏水清洗细胞3次，去上清，加入5 mL 95%乙醇脱色处理，冷却后于485 nm處测定吸光度。

1.2.4 丙二醛（MDA）含量测定。

参照《植物生理生化实验原理和技术》[14]中试验方法，精确称取2.00 g白桦悬浮细胞后，加入5 mL蒸馏水研磨。将5 mL 0.5 mol/L硫代巴比妥酸（TBA）溶液和待测研磨液置于10 mL离心管中，沸水浴10 min，冷却后3 000 r/min离心10 min，取上清液。分别测定450、532和600 nm处吸光度，根据公式计算白桦悬浮细胞中MDA含量：MDA含量=[6.45×（A532-A600）-0.56×A450]×提取液体积/（测定液体积×鲜重）。

1.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性测定及基因表达。

1.2.5.1 酶粗提取液的制备。参照刘英甜等[11]试验方法，精确称取1.00 g白桦悬浮细胞于预冷研钵中，加入4 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.0）及少量交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）充分研磨，4  ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清液为酶粗提液。

1.2.5.2 SOD活性测定。将0.3 mL 酶粗提液和0.3 mL 提取液分别加入测定管和对照管中，同时分别加入1.5 mL 50 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 7.0）、0.3 mL 130 mmol/L 蛋氨酸（现用现配）、0.3 mL 750 mmol/L 氯化硝基四氮唑蓝（现用现配）、0.3 mL 100 μmol/L 乙二胺四乙酸二钠和0.3 mL 20 μmol/L 核黄素。反应20 min，将对照组置于黑暗中，试验组于自然光下，反应20 min后测定560 nm处吸光度。

1.2.5.3 POD活性测定。将0.5 mL 酶粗提液、3.9 mL 50 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 7.0）、1.0 mL 2% 过氧化氢溶液、20 μL 0.05 mol/L愈创木酚混合均匀后立即测定470 nm处吸光度，1 min后再次测定470 nm处吸光度。

1.2.5.4 基因表达分析。采用北京全式金生物技术有限公司qPCR SuperMix试剂盒进行实时荧光定量PCR，对SOD、POD基因表达量进行分析。基因表达量的计算方法参照Livak等[15]方法，以白桦内参基因TU为内标参照，目的基因的相对表达量用2-△△CT[15]来表示。BpSOD上下游引物分别为F：ACAGTCAGGGTGTCAGTGGGA和R：CAGCAGGATTGAAATGTGGC;BpPOD上下游引物分别为F：AGGAACTTTAGGCACATCG和R：AGATGCTCTCATTGTGGTC。

1.2.6 NO含量测定。NO含量采用NO试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）进行测定。利用Griess法检测细胞中NO含量，将白桦悬浮细胞培养液4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，取上清液，分别在空白管和测定管中加入提取液和样品400 μL 后，加入试剂混匀，室温静置15 min后在550 nm下测定吸光度。

1.2.7 亚硝基硫醇（SNO）含量测定。参照黄雅婷等[16]方法，精确称取4.00 g白桦悬浮细胞置于预冷研钵中，加入6  mL 0.1 mol/L pH 7.2的Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，4 ℃ 10 000 r/min 离心15 min，分别取2  mL上清液于2个离心管中，试验组加1  mL试剂Ⅲ 40 ℃水浴避光反应5 min;对照组加入1 mL 试剂 Ⅰ 40 ℃水浴避光反应5 min，试验组和对照组再同时加入1  mL试剂 Ⅱ 40 ℃水浴避光反应5 min，测定540 nm 处吸光度。

2 结果与分析

2.1 白桦酯醇对白桦悬浮细胞生长的影响

将0.1、0.5、1.0和5.0 μmol/L白桦酯醇分别添加到培养7 d的白桦悬浮培养体系中处理12 h、7 d和14 d，其外观表型如图1所示，白桦悬浮细胞的颜色随着培养时间的增加由浅绿色变为翠绿色最后变为浅黄色，其固液比例也基本相同;TTC法分析白桦悬浮细胞活力如图2所示，不同浓度的白桦酯醇处理与同期对照基本相同且无显著差异，在处理的第7天时细胞活力达最大值，为1.64～1.69;白桦悬浮细胞的鲜重随着处理时间的增加呈现增加趋势，在处理的第14天时达最大值，为38.8～40.1;不同浓度的白桦酯醇处理与对照之间鲜重无显著差异（图3）。

2.2 白桦酯醇对白桦悬浮细胞培养液pH和电导率的影响

从不同浓度的白桦酯醇处理后白桦悬浮细胞培养液pH变化（图4A）可以看出，随着处理时间的延长pH呈增加趋势，在处理的第14天达最大值，为11.1～12.1，同期处理与对照之间无显著差异;如图4B所示，电导率随着白桦酯醇处理时间的延长呈现降低趋势，在白樺酯醇处理的第14天达最小值，为35.2～38.1，同期处理与对照之间也无显著差异。上述结果表明白桦酯醇对细胞培养液pH和电导率未产生影响。

2.3 白桦酯醇对白桦悬浮细胞中MDA含量的影响

TBA法分析白桦悬浮细胞中MDA含量结果如图5所示，不同浓度的白桦酯醇处理14 d时，白桦悬浮细胞中MDA含量平均比处理12 h和7 d时分别高出104.25%和103.19%。

2.4 白桦酯醇对SOD和POD活性及其基因表达的影响

从图6可以看出，

不同浓度的白桦酯醇处理下白桦悬浮细胞中SOD活性及其基因表达基本呈现增加趋势，其中处理14 d时白桦悬浮细胞中SOD活性及其基因表达平均比处理12 h分别增加了148.29%、352.19%。不同浓度的白桦酯醇处理下白桦悬浮细胞中POD活性及其基因表达变化趋势与SOD基本相似，但变化幅度不同;白桦酯醇处理14 d时白桦悬浮细胞中POD活性及其基因表达平均比处理12 h分别增加了136.25%和393.96%。

2.5 白桦酯醇处理对白桦悬浮细胞中NO和SNO含量的影响

从不同浓度白桦酯醇处理白桦悬浮细胞7 d后细胞培养液中NO含量（图7A）可以看出，0.1和0.5 μmol/L白桦酯醇处理下NO含量与同期对照相比无显著差异，1.0和5.0 μmol/L 白桦酯醇处理下NO含量显著增加，分别比同期对照增加了159.87%和178.95%。SNO是NO与含巯基的硫醇结合形成的，生物体内SNO含量很大程度上代表着体内结

合态NO含量。不同浓度白桦酯醇处理下白桦悬浮细胞中SNO含量无显著差异（图7B）。

3 讨论与结论

次生代谢物是植物长期适应生态环境的结果，在植物受到外界刺激引起过敏反应时，次生代谢物会累积增强自身抵抗力。此外，它还可以影响自身或邻近植物的生长发育[17]，如人参皂苷粗提液对西洋参早期生长产生抑制作用;鼠尾草叶片中的挥发性萜类物质会导致黄瓜根尖细胞中脂质小体的积累、线粒体等细胞器数目下降以及细胞器外膜的破裂;倍半萜内酯混合物银胶菊碱在低浓度下抑制其幼苗的生长[18-20]。但是次生代谢物影响自身或邻近植物生长发育的机制还未完全揭示，尤其从细胞水平上。

白桦酯醇室温下微溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂[21]。白桦悬浮培养液不同于普通自来水，它里面不仅添加细胞生长所需营养成分，还有细胞自身培养过程中分泌或代谢的一些物质。为了确定白桦酯醇的最大溶解浓度，该研究通过向培养第7天的白桦悬浮细胞培养液中不断添加白桦酯醇，以能溶解且培养1 d后不再析出为标准，确定其最大溶解浓度为5.0 μmol/L。因此，该研究将0.1～5.0 μmol/L白桦酯醇分别添加到培养7 d的白桦悬浮细胞培养体系中解析其对白桦悬浮细胞生长生理的影响。

范桂枝等[22]研究发现，在 1 个培养周期内（24 d），白桦悬浮细胞培养过程中三萜的产量与细胞生物量是相偶联的，随着生物量的增加三萜产量呈增长趋势。白桦悬浮细胞在第 12天比生长速率达到最高，三萜合成速率和比合成速率在第 9天达到最高值。鉴于此，该试验将白桦酯醇添加时间选在其累积高峰前期添加。研究发现，0.1～5.0 μmol/L白桦酯醇处理12 h～14 d，白桦悬浮细胞的外观颜色、细胞活力和鲜重以及培养液的pH和电导率与同期对照相比均无显著差异。由此推断，0.1～5.0 μmol/L白桦酯醇对白桦悬浮细胞的生长不产生影响。

在正常生长发育和应激条件下，活性氧（ROS）均会在植物细胞的线粒体和叶绿体等细胞器中产生[23-24]，ROS 包括单线态氧（1O2）、超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2 ）和羟基自由基（·OH）。过量的 ROS对细胞有很强的毒害作用，它会打破细胞内氧化还原平衡;而适量的ROS对植物生长代谢是有利的，可作为关键信号分子激活第二信使、转录因子和改变酶活性来调控植物的生长发育[25-26]。SOD能够催化O2-歧化生成O2和H2O2，POD将H2O2 还原为H2O，二者均是植物体内的保护酶;MDA是膜质过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物受伤害的程度[27-28]。该试验考察白桦酯醇处理下上述指标发现，白桦酯醇处理下MDA含量、SOD和POD活性及其基因表达水平基本呈增加趋势，且与同期对照相比存在显著差异。由此可见，白桦酯醇对白桦悬浮细胞中ROS水平产生了影响。由于白桦酯醇添加后SOD等活性增加，可以推断白桦酯醇可以提高白桦悬浮细胞的抗氧化能力，并且它对白桦悬浮细胞活力未产生负面影响。

NO是植物体内具有信号转导作用和生物活性的分子，同时NO可以改变次生代谢途径中催化酶的活力或者活化次生代谢途径中特定酶基因，从而提高次生代谢物产量。如NO促进了黄岑苷、金丝桃素和葛根素在悬浮细胞中的积累[29-31]。同样，东北林业大学森林生物工程实验室前期也证实NO可以促进白桦酯醇等三萜的合成[32]。该研究发现，低浓度的白桦酯醇对NO未产生显著影响，高浓度的白桦酯醇显著提高了NO含量。考察NO在植物体内的次级产物SNO发现，白桦酯醇对SNO产生影响不显著。综上推断，白桦酯醇可以改变白桦悬浮细胞中NO的累积，其促进效应存在浓度关系，而SNO未随之增加还需进一步探究。

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