1株异养硝化-好氧反硝化神户肠杆菌的鉴定及脱氮特性

胡丹 何富强 杜全能 王刚 兰时乐

摘要 [目的]鑒定1株异养硝化-好氧反硝化神户肠杆菌，明确其脱氮特性。[方法]从养殖池塘底泥中筛选到1株异养硝化-好氧反硝化菌HD-NAH，经形态学观察、生理生化试验以及16S rDNA序列分析，鉴定为神户肠杆菌（Enterobacter kobei）HD-NAH，并研究其脱氮特性。[结果]该菌在以柠檬酸钠为碳源，C/N为18，初始pH为7，温度为27 ℃，转速为190 r/min时，24 h亚硝氮（NO2--N）和总氮（TN）降解率分别为99.98%和89.37%，具有较高的降解效率。菌株在初始pH为7～10，温度为27～37 ℃，转速为130～210 r/min时，对NO2--N和TN的降解率均较高，表明该菌株的环境适应性较强。在不同氮源条件下，菌株HD-NAH对氮的去除存在差异，其对TN去除率表现为NO2--N>NH4+-N+NO2--N>NH+4-N+NO3--N>NH4+-N>NO3--N，还存在一定短程异养硝化-好氧反硝化过程。[结论]菌株HD-NAH良好的脱氮特性可为养殖废水除氮提供可选择材料。

关键词 神户肠杆菌HD-NAH;异养硝化;好氧反硝化;脱氮特性

中图分类号 X172  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）10-0070-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.018

Identification of a Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrifying Bacterium and Its Removal Characteristics of Nitrogen

HU Dan1，2，HE Fu-qiang1，DU Quan-neng3 et al （1.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128; 2.Hunan Institute of Microbiology，Changsha，Hunan 410009; 3.Haida Research Institute of Guangdong Haida Group Co.，Ltd，Guangzhou，Guangdong 511400）

Abstract [Objective]To identify a heterotrophic nitrification-aerobic denitrifying bacterium，and clarify its denitrification characteristics.[Method]A heterotrophic nitrification-aerobic denitrifying bacterium was screened from the sludge of aquaculture pond，was named as HD-NAH.The strain was identified as Enterobacter kobei by morphological observation，physiological and biochemical tests，and 16S rDNA sequence analysis.The removal characteristics of nitrite nitrogen and total nitrogen by HD-NAH were studied.[Result]The results showed that degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen by strain HD-NAH were 99.98% and 89.37% respectively，under the conditions of trisodium citrate as the sole carbon source，C/N 18，pH 7，appropriate culture temperature 27 ℃ and shaking speed 190 r/min.The strain HD-NAH had preferable degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen under pH 7-10，temperature 27-37 ℃，and shaking speed 130-210 r/min，it means that strain HD-NAH has strong environmental adaptability.The degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen were measured under different nitrogen source，the rate was arranged as：NO2--N>NH4+-N+NO2--N>NH+4-N+NO3--N>NH4+-N>NO3--N.The strain showed a certain short-range heterotrophic nitrification-aerobic denitrification process.[Conclusion]It provided an alternative material for the denitrification of aquaculture wastewater basing on good denitrification characteristics of the strain HD-NAH.

Key words Enterobacter kobei HD-NAH;Heterotrophic nitrification;Aerobic denitrification;Denitrification characteristics

基金项目 湖南省重点研发项目（2016NK2103）;湖南创新型省份建设经费资助项目（2020NK2029）。

作者简介 胡丹（1989—），女，湖南桃江人，助理工程师，硕士，从事环境重金属检测研究。 通信作者，副教授，从事微生物资源利用研究。

收稿日期 2021-07-06

水体氮元素的大量累积会造成水体富营养化和生态失衡等一系列问题，严重威胁水生生物的生存和健康，制约我国养殖业的持续发展。在处理水体氮污染过程中，微生物起着重要作用，可通过氨化、硝化和反硝化等过程减少水体中的氮含量，从而达到脱氮目的[1]。传统认为微生物的硝化和反硝化是2个独立的过程，直到1984年，Robertson等[2]发现一种能进行异养硝化-好氧反硝化的脱氮副球菌（Paracocci denitrificans），并提出了异养硝化-好氧反硝化的概念。异养硝化-好氧反硝化细菌可在有氧条件下利用有机碳源和有机氮源进行生长，在降低有机物含量的同时，利用自发反应去除水体中有毒的氨氮与亚硝酸盐氮，且除氮率高、除氮速率快，避免了二次污染，受到广泛关注[3-5]。

异养硝化-好氧反硝化细菌的发现，为生物脱氮提供了新的研究方向。近年来，许多研究者从自然界分离了诸多异养硝化-好氧反硝化菌并对其脱氮进行了研究，包括假单胞菌（Pseudomonas sp.）[6]、无色杆菌（Achromobacter sp.）[7]、芽孢杆菌（Bacillus sp.）[8]、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）[9]和农杆菌属（Agrobacterium sp.）[10]等细菌及皱褶念珠菌（Diutina rugosa）[11]等真菌。一些细菌在实际水体的应用中取得了良好效果，如魔鬼弧菌（Vibrio diabolicus）SF16对含盐废水的氨氮和总氮去除率分別达到97.14%和73.92%[12]，Acinetobacter sp.T1能够明显提高养猪场废水中的氮去除率[13]。因此，筛选出更多高效除氮的菌种资源，对于利用微生物进行氮污染环境修复有着重要意义。该研究从淡水养殖池塘底泥中分离到1株高效异养硝化-好氧反硝化菌株HD-NAH，经形态学观察、生理生化试验并结合16S rDNA序列分析，鉴定为神户肠杆菌，目前有关该菌用于生物脱氮方面的研究鲜见报道。笔者进一步探讨了该菌株异养硝化-好氧反硝化的影响因素，以期为菌株HD-NAH应用于淡水养殖废水的除氮处理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种分离样品。采集于湖南省长沙市东湖养殖场池塘底泥，装于无菌玻璃瓶中，迅速带回实验室进行富集培养和菌株分离。

1.1.2 培养基。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH自然。加入2%琼脂，制成斜面培养基。

反硝化培养基：柠檬酸钠9.0 g/L，NaNO2 0.6 g/L，Na2HPO4 1.0 g/L，NaH2PO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl2·2H2O 0.2 g/L，1%溴麝香草酚蓝（Bromothymol Blue，BTB）1.0 mL/L，琼脂2%，pH 7.0。基础脱氮培养基：成分同反硝化培养基，不添加1% BTB和琼脂。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的富集与初筛。

称取10 g池塘底泥于100 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，32 ℃ 170 r/min摇床中富集培养72 h后，按10倍稀释法将富集液稀释至10-8。分别取最后3个稀释度的稀释液0.1 mL涂布于反硝化固体培养基平板上，32 ℃ 恒温培养箱中培养至长出单菌落后，挑取不同形态的单菌落进行纯化并编号。

1.2.2 菌种复筛。

将分离纯化的菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，32 ℃ 170 r/min条件下振荡培养24 h后，离心收集菌体，使用基础脱氮培养基洗涤菌体2次，等体积基础脱氮培养基悬浮菌体，按1%（V/V）接种量分别接种于基础脱氮培养基中，32 ℃ 170 r/min条件下振荡培养48 h后，测定菌株对亚硝氮（NO2--N）的去除率。

1.2.3 菌种鉴定。参照《常见细菌系统鉴定手册》[14]，对菌株HD-NAH的菌落和菌体形态进行观察并分析菌株的常规生理生化指标。采用DNA提取试剂盒（SK8257，上海生工生物工程股份有限公司）提取菌株的基因组DNA，通过PCR扩增16S rDNA序列。PCR体系（25 μL）：10×Buffer （Mg2+） 2.5 μL、dNTP 1 μL、Taq酶 0.2 μL、引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′）各0.5 μL、模板0.5 μL，用无菌ddH2O定容至25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，循环35次，72 ℃延伸10 min。测序后将16S rDNA序列提交至NCBI，使用Blastn检索比对，用MEGA 7.0.26软件的邻位连接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树，bootstrap自展1 000次检验。

1.2.4 菌株HD-NAH脱氮特性研究。采用单因素试验法，分别改变基础脱氮培养基的碳源种类（柠檬酸钠、碳酸钠、丁二酸钠、酒石酸钠和蔗糖）、C/N（2、6、10、14、18、22）、初始pH（6、7、8、9、10）、温度（22、27、32、37、42 ℃）、摇床转速（130、150、170、190、210 r/min）和氮源种类（121.74 mg/L NH4Cl、121.74 mg/L NaNO3、121.74 mg/L NaNO2、60.87 mg/L NH4Cl+60.87 mg/L NaNO3、60.87 mg/L NH4Cl+60.87 mg/L NaNO2），探讨不同条件下菌株HD-NAH的脱氮性能。

1.2.5 测定方法。

参照文献[15]中的方法测定发酵液上清液中氨氮（NH4+-N）、亚硝氮（NO2--N）、硝态氮（NO3--N）和总氮（TN）含量。

1.2.6 数据处理。

使用GraphPad Prism 8.0.1对数据进行处理。采用SPSS 25.0统计软件对数据进行one-way ANOVA分析和Tukey’s HSD 检验（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 菌种的筛选

从养殖水体底泥中筛选菌种，通过富集和平板分离，共获得11株具有反硝化能力的菌株，分别命名为HD-NAH、HD-NBH、HD-NCH、HD-NDH、HD-NEH、HD-NFH、HD-NGH、HD-NHH、HD-NJH、HD-NMH、HD-NNH。将分离的11株菌株分别接种至牛肉膏蛋白胨培养基，32 ℃ 170 r/min振荡培养24 h后，按1%（V/V）的接种量接入基础发酵培养基中，同样条件下发酵48 h，测定发酵液中NO2--N含量。从图1可见，分离筛选的11株细菌均具有NO2--N的降解能力，菌株HD-NAH对NO2--N的去除率最大，达到94.36%。因此，选择该菌株进行后续研究。

2.2 菌株HD-NAH鉴定

2.2.1 菌株形态观察。

菌株HD-NAH在反硝化培养基上培养24 h后的菌落形态为圆形，较小，白色，表面湿润光滑，边缘整齐，半透明;显微镜下细菌形态特征呈短杆状、无芽孢，周生鞭毛。

2.2.2 生理生化指标。

菌株HD-NAH的半乳糖、V-P反应、硝酸盐还原、亚硝酸盐还原发酵为阳性;麦芽糖、MR反应、水解淀粉、吲哚和纤维素水解发酵为阴性（表1）。该菌株的生理生化特征与《常见细菌系统鉴定手册》[14]中的肠杆菌属基本一致。

2.2.3 16S rDNA序列及系统发育树的构建。

使用通用引物27F/1492R对菌株HD-NAH的16S rDNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶检测PCR产物，在1 500 bp处有明顯条带（图2A），长度为1 475 bp。Blast比对分析后采用MEGA 7.0.26软件对选取的序列进行系统发育树构建，结果见图2B。菌株HD-NAH与神户肠杆菌STW0522-51及Enterobacter kobei strain WCHEK045523的亲缘关系最近。结合形态学和生理生化试验结果，将菌株HD-NAH鉴定为神户肠杆菌。

2.3 菌株HD-NAH脱氮特性

2.3.1 碳源对菌株HD-NAH脱氮特性的影响。

从图3可见，不同碳源对菌株HD-NAH的NO2--N、TN降解率存在显著影响（P<0.05）。以柠檬酸钠为碳源时，NO2--N、TN的降解率最高，分别为75.21%和57.23%。因此，选择柠檬酸钠为碳源进行后续脱氮特性研究。

2.3.2 C/N对菌株HD-NAH脱氮特性的影响。

通过改变培养基中碳源的含量，测定了菌株在6种不同C/N条件下的脱氮情况。结果表明（图4），C/N对菌株脱氮具有显著影响（P<0.05）。C/N在6～18时，NO2--N、TN的降解率随着C/N的升高而增加;在C/N为18时，NO2--N、TN的降解率均达到最高，分别为91.56%和66.95%;C/N大于18时，NO2--N、TN的降解率均下降。因此，选择C/N为18进行后续试验。

2.3.3 初始pH对菌株HD-NAH脱氮特性的影响。培养基pH主要影响生物的细胞膜电荷量、细胞膜通透性以及对营养物质的吸收。从图5可知，菌株在中性和碱性环境（pH≥7）对

NO2--N、TN的降解率明显高于酸性环境（pH为6）。在pH为7～10时，NO2--N的降解率均超过93.01%。初始pH为7时，NO2--N、TN的降解率最佳，分别为95.66%和79.43%。但当pH高于9时，NO2--N、TN的降解率反而下降。以上结果说明菌株HD-NAH对中性和碱性环境具有较广的适应性，在pH 7～10对氮具有较高的去除率，因此后续选择pH为7进行试验。

2.3.4 培养温度对菌株HD-NAH脱氮特性的影响。

温度主要影响酶促反应速率、细胞膜的流动性和营养物质的离子化程度，从而影响微生物代谢产物的合成。从图6可见，菌株HD-NAH具有较广的脱氮温度适应性，在27～37 ℃时，对NO2--N、TN的降解率无显著差异（P>0.05），27 ℃为最佳氮去除温度，NO2--N、TN的降解率分别达到99.95%和84.64%。当温度低于27 ℃或高于37 ℃时，NO2--N、TN的降解率下降。因此，选择培养温度为27 ℃进行后续试验。

2.3.5 摇床转速对菌株HD-NAH脱氮特性的影响。摇床转速主要影响培养过程的溶氧量。从图7可见，摇床转速在130～210 r/min时，菌株对TN的降解率无显著影响（P>0.05），TN的降解率在81.75%～89.37%;转速为150～210 r/min时，菌株对NO2--N的降解率也无显著影响（P>0.05），NO2--N的降解率均超过99.90%;当摇床转速为190 r/min时，NO2--N、TN的降解率均为最高，分别达99.98%和89.37%。

2.3.6 氮源种类对菌株HD-NAH脱氮特性的影响。

由表2可知，在以NH4+-N为唯一氮源时，NH4+-N的去除率达到87.68%，平均降解速率为4.45 mg/（L·h），TN去除率为70.43%，且NO3--N残留浓度仅2.90 mg/L。以NO3--N为唯一氮源时，NO3--N的去除率为74.50%，平均除氮速率为3.78 mg/（L·h），TN去除率为69.59%，且NO2--N积累较少，仅5.23 mg/L。以NO2--N为唯一氮源时，NO2--N的去除率为99.84%，平均除氮速率为5.06 mg/（L·h），TN去除率为91.60%，且NO2--N残留浓度为1.10 mg/L。以NH4+-N+NO3--N为混合氮源，NH4+-N去除率为83.65%，平均除氮速率为2.12 mg/（L·h），NO3--N去除率为96.63%，平均除氮速率为2.45 mg/（L·h），TN去除率为88.45%;以

NH4+-N+NO2--N為混合氮源的条件下，NH4+-N去除率为83.21%，平均除氮速率为2.11 mg/（L·h），NO2--N去除率为96.34%，平均除氮速率为2.44 mg/（L·h），TN去除率为89.29%。以上结果表明，单一氮源时，菌株对NO2--N的去除速率和去除率最高，对NO3--N的去除速率和去除率最低。对TN的去除速率和去除率表现为NO2--N>NH4+-N+NO2--N>NH4+-N+NO3--N>NH4+-N>NO3--N。

3 讨论

菌株HD-NAH以柠檬酸钠为唯一碳源时具有较好的脱氮性能，而以碳酸钠、丁二酸钠、酒石酸钠和蔗糖为碳源时，NO2--N和TN的降解率均很低，这与P.stutzeri HJ-7结果一致，该菌以柠檬酸钠为唯一碳源时，30 h能去除水体中全部氨氮[16]。但与其他研究中的一些菌株有差异，如P.stutzeri YG-24在以蔗糖为唯一碳源进行反硝化过程中对NO2--N的去除效果最好[17]，P.putida HJH1和Klebsiella oxytoca HJH2以甘油作为唯一碳源时，对NO2--N的降解率最高[18]。可见，碳源种类对菌株的脱氮性能影响较大。

在C/N低于6时，菌株HD-NAH对NO2--N的降解率均很低，这是由于过低的碳源难以为细菌的生存提供足够的能源，导致其生长缓慢;当C/N在6～18时，菌株除氮率随C/N升高而上升，但随C/N继续增大除氮率反而下降，这是由于过高的C/N会抑制细菌的生长和氮的去除[19]，这与P.chengduensis ADM 2-2 C/N为5～11、P.chloritidismutans ADM 8-1 C/N为5～13[20]的除氮趋势一致。可见，C/N的高低对菌株的除氮性能影响很大。

酸性环境抑制菌株生长，可能是酸性环境会抑制该菌株功能酶活性和细菌代谢活性，这与Acinetobacter sp.GNR等菌株一致[21]。但菌株HD-NAH在pH为7～9时对NO2--N、TN的去除率分别超过95.0%和79.0%，说明中性和碱性环境有利于该菌株的生长和反硝化作用，即使在pH为10的强碱性环境下，菌株对NO2--N、TN的降解率也能达到93.01%和70.38%，表明该菌株耐碱能力强。

菌株HD-NAH在温度为27 ℃时的氮降解率最佳，且在27～37 ℃均能高效去除NO2--N、TN，对温度的适应范围较广，这与诸多传统硝化-反硝化微生物的最适温度在25～37 ℃一致[22]。

转速主要影响发酵过程中的溶氧量，溶氧量的高低会影响菌株的生长。该研究菌株HD-NAH在5个转速条件下除氮率均较高，说明菌株HD-NAH能在较广的溶氧量范围进行脱氮，这比一些除氮微生物只能耐受较低的氧浓度有明显优势[23]。

氮源种类测试结果表明，菌株HD-NAH有较好的异养硝化-好氧反硝化能力，当环境中

NH4+-N浓度较高时（以NH4+-N为唯一氮源），存在一定NO2--N积累，但NO3--N积累较少，当环境中NH4+-N浓度较低时（以NO3--N或NO2--N为唯一氮源），NO3--N具有一定积累，且NO2--N积累较少，这说明该菌在水中NH4+-N浓度较高时，pH偏碱性，易形成亚硝酸型硝化，在相反的条件下，则形成硝酸型硝化的倾向很大，存在一定短程异养硝化-好氧反硝化过程。

4 结论

从养殖池塘底泥样品中筛选到1株神户肠杆菌（Enterobacter kobei）HD-NAH，该菌具有较高NO2--N、TN降解率。菌株HD-NAH去除NO2--N的适宜条件为：碳源为柠檬酸钠，C/N为18，初始pH为7，温度为27 ℃，转速为190 r/min，24 h内对NO2--N、TN降解率分别为99.98%和89.37%。不同氮源条件下，菌株HD-NAH在低NH4+-N浓度中易形成硝酸型硝化，在高NH4+-N浓度中存在一定短程异养硝化-好氧反硝化过程。该研究将获得的神户肠杆菌用于水体生物脱氮，至于其在含氮废水中的实际应用有待进一步研究。

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