立枯丝核菌拮抗青霉菌发酵液稳定性研究

安婧婧 沈瑞清

摘要 研究立枯丝核菌拮抗青霉菌绳状青霉和草酸青霉发酵液稳定性，为今后生防青霉菌的开发提供理论依据。采用牛津杯法测定立枯丝核菌拮抗青霉菌绳状青霉、草酸青霉发酵液对于温度和酸碱度的稳定性，结果发现，绳状青霉菌株发酵液在20 ℃、处理10 min和pH=3、处理2 h的情况下，抑菌活性最高，而当温度超过50 ℃，中性条件会抑制绳状青霉菌株的抑菌活性;草酸青霉菌株发酵液在40 ℃、处理10 min和pH=9、处理2 h的情况下抑菌活性最高，而当温度超过60 ℃，中性条件或过碱性条件会抑制该菌株的抑菌活性。

关键词 拮抗菌;发酵液;稳定性;牛津杯法

中图分类号 S 432.4 +4  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）08-0129-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.035

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Stability of Fermentation Penicillium Produced by Antagonistic Strain against Rhizoctonia solani

AN Jing-jing 1，SHEN Rui-qing 2 （1.Agricultural，Rural and Water Bureau of Xingqing，Yinchuan，Ningxia 750001;2.Institute of Plant Protection，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan，Ningxia 750001）

Abstract To explore the stability of fermentation Penicillium funiculosum produced by antagonistic strain against Rhizoctonia solani，which could provide theory basis for the future development of Rhizoctonia solani biocontrol agents. This study tested the temperature stability，acid and alkali stability of fermentation Penicillium funiculosum and Penicillium oxalicum produced by antagonistic strain against Rhizoctonia SolaniIn by Oxford cup method.The study showed that Penicillium funiculosum had the highest antibacterial activity while 20 ℃，10 min and pH=3，2 h，but when the temperature was higher than 50 ℃，and neutral conditions would  inhibit the antibacterial activity of  its strain，and Penicillium oxalicum had the highest antibacterial activity while 40 ℃，10 min and pH=9，2 h，but when the temperature was higher than 60 ℃，and neutral conditions and more alkaline conditions would inhibit the antibacterial activity of  its strain.

Key words Antagonistic bacteria;Fermentation broth;Stability;Oxford cup method

立枯絲核菌（Rhizoctonia solani） 分布广泛，适应能力强，生长速度快，由它引起的立枯病在全国各地均有不同程度的发生，尤其在育苗中后期发病严重，常造成大量死苗甚至毁床 [1-2]。近年宁夏区内有许多马铃薯种植区无法倒茬，致使土壤中病原菌数量逐年增加，因此加重了黑痣病的发生并带来了较大的经济损失 [3]。目前对于病原真菌的控制方法主要有加强田间管理、培育抗病品种、使用化学药剂等。但在实践中发现这些方法都很难达到防治效果，因此采用生防制剂防治病原微生物受到越来越多的重视，且已经成为防治植物病害的重要途径。生防制剂在实际应用过程中，容易受到自身稳定性的影响，同时其生物活性物质能否有效地发挥作用也与自身的稳定性有密切关系 [4-6]。即使筛选得到了抑菌效果良好的菌株，也可能因生物活性物质稳定性差而无法在生产实践中应用，因此对拮抗生防菌抑菌活性稳定性探究十分必要。笔者对立枯丝核菌拮抗青霉菌发酵液稳定性进行研究，为生防菌的开发和抑菌活性物质的分离纯化提供理论依据 [6-8]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 立枯丝核菌。立枯丝核菌来自宁夏农林科学院植物保护研究所植物病理实验室，分离自立枯丝核菌侵染的马铃薯病薯。

1.1.2 青霉菌。毒霉菌分离自土壤中。

1.1.3 培养基。发酵所用的培养基为PDA液体培养基;对峙所用的培养基为PDA培养基 [9]。

1.2 方法

1.2.1 拮抗青霉菌菌株发酵液的制备。

将接于PDA平板上经活化的绳状青霉菌和草酸青霉菌用直径5 mm的打菌器打成菌饼，接于50 mL的PDA液体培养基中，在摇床上振

荡3 d，将发酵液在高速离心机800 r/min下离心15 min，后用微孔滤膜过滤，得到青霉菌菌株的无菌发酵液 [10-11]。

1.2.2 菌株发酵液对温度的稳定性。

将菌株的浓缩发酵液分别在20、30、40、50、60 ℃条件下处理10、20、30 min后，吸取5 μL浓缩发酵液，用牛津杯法做与立枯丝核菌的对峙试验，每个温度梯度重复3次，根据其生长情况测定发酵液对温度的稳定性。

1.2.3 菌株发酵液对pH的稳定性。分别配制1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH，用该酸和碱将无菌发酵液的pH分别调至3、5、7、9、11后，分别放置1、2、3 h，再将发酵液调回到原始酸碱度，吸取浓缩发酵液5 μL，用牛津杯法做与禾谷镰刀菌的对峙试验，每个梯度重复3次，根据菌株生长情况测定发酵液对酸碱的稳定性。

2 结果与分析

2.1 绳状青霉菌株对温度和pH的稳定性 绳状青霉菌株无菌发酵液在试验各温度梯度处理不同时间后与立枯丝核菌做对峙培养的生长情况见表1。从表1可以看出，在所有温度梯度的不同时间处理下，拮抗活性最好的处理是20 ℃、10 min，在20～40 ℃的处理温度下，其拮抗活性的变化没有明显规律，当温度升高到50 ℃时，菌株发酵液的拮抗活性随温度的升高和处理时间的增长而呈下降趋势，即当温度升高到50 ℃，菌株发酵液的抑菌活性开始下降，且随着处理时间的增长，下降幅度越大，但當温度升高到60 ℃时，则抑制了菌株发酵液的生长。由此可知，立枯丝核菌拮抗绳状青霉的抑菌活性物质在40 ℃以下具有相对稳定性，对高温不具有耐受力。

绳状青霉菌株发酵液在不同pH下处理不同时间后与立枯丝核菌做对峙试验，结果见表2。由表2可知，在所有处理中，pH=3、处理2 h时菌株发酵液具有最高活性，其生长势最好，对立枯丝核菌的抑制效果最强，pH=9、处理1 h抑制效果次之。而抑菌活性最弱的处理是pH=7、处理2 h，表现为生长势最弱。其他不同pH下的处理之间和相同pH不同时间的处理之间均无显著差异。由此可知，立枯丝核菌拮抗绳状青霉菌菌株的抑菌物质在酸性和碱性条件下均能发生抑菌作用，而在中性条件下抑菌活性最低，即中性条件会抑制该菌株发酵液的抑菌活性。

2.2 草酸青霉菌株对温度和pH的稳定性 草酸青霉菌株无菌发酵液在试验各温度梯度下处理不同时间后与立枯丝核菌对峙培养的生长情况见表3。由表3可知，在40 ℃、10 min的处理下，该菌株发酵液的生长情况最好，与未经处理的对照组最为接近。20 ℃、20 min的处理和60 ℃、10 min的处理次之，生长情况最差的是50 ℃、30 min的处理，而当60 ℃处理20 min以上则完全抑制菌株发酵液的生长，其他处理之间差异不大。单看各温度的组内处理之间的生长情况，发现除20 ℃外，其他温度组内处理之间都是10 min处理下的生长情况优于20、30 min处理下的生长情况。由此可知，立枯丝核菌生防青霉菌草酸青霉菌株发酵液在40 ℃、处理10 min时具有最高活性，对高温不具有耐受力且处理时间不宜过长。

草酸青霉菌株发酵液在不同pH下处理不同时间后与立枯丝核菌做对峙试验的生长情况见表4。由表4可知，在pH=9、处理2 h时，该菌株发酵液具有最高抑菌活性，pH=5、处理1 h时抑菌活性次之，而在pH=11、处理3 h时抑菌活性最低，表现为生长状况最差。从整体看，抑菌情况最差的是pH为7和11时，由此可以推断，该立枯丝核菌拮抗青霉菌草酸青霉菌株发酵液在中性条件和偏碱性条件下抑菌效果较差，即这2种条件会抑制该菌株发酵液的抑菌活性。

3 结论与讨论

生物防治是克服化学农药负效应的一条有效途径 [6]，筛选生防菌、生防制剂等对于防治立枯丝核菌病具有十分重要的意义。该试验从土壤中筛选得到2株对立枯丝核菌拮抗作用较好的生防青霉菌，探究了温度和pH对其抑菌活性的影响，结果表明，绳状青霉菌菌株发酵液在温度20 ℃、处理10 min和pH=3、处理2 h时，抑菌效果达到最好，对中性条件和高温不具有耐受力。草酸青霉菌株发酵液在40 ℃、处理10 min和pH=9、处理2 h的情况下抑菌活性最高，对高温、中性或过碱性条件不具有耐受力。

该研究结果表明，这2株拮抗青霉菌均具有相对稳定的热稳定性和酸碱稳定性，因此具有可开发成生防制剂的潜能。当然温度和pH也只是影响抑菌活性的部分因素，还有其他影响因子，如紫外光照射、无菌发酵液的培养条件 [12]等，都需进一步进行验证，此外，还需要进行田间防病试验，进一步检验其防效的稳定性，以便应用于生产实践，更好地发挥其生防作用。

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