贻贝粗多糖对环磷酰胺致小鼠免疫低下及生殖遗传毒性的保护作用

何嘉桃 苏泽椿 孙东方 黄达荣 王倩文 陈影聪 孙力军

摘要 [目的] 研究貽贝粗多糖对免疫抑制小鼠的免疫功能、生殖能力和遗传稳定性的作用效果。[方法] 采用环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，同时灌胃木瓜蛋白酶提取的贻贝多糖进行干预，7 d后测定体重、器官指数、血常规、骨髓细胞微核率、精子致畸率。[结果] 与对照组相比，在第7天模型组小鼠的体重显著下降，胸腺指数明显降低34.6%，肠指数、心脏指数分别显著升高73.4%、43.6%，小鼠的白细胞、红细胞、血小板、红细胞平均体积、红细胞压积下降，淋巴细胞、中间细胞、中性粒细胞的百分比失衡，微核率和精子畸变率分别提高了17.67千分点和7.77百分点。与模型组相比，低、高剂量组在以上指标均有不同程度的改善。[结论] 一定剂量的贻贝粗多糖能改善环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠的免疫功能，缓解环磷酰胺导致的遗传毒性和生殖毒性。

关键词 贻贝粗多糖;环磷酰胺;免疫抑制;生殖遗传毒性

中图分类号 TS 201.4  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）03-0170-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.046

Protective Effects of Mussel Crude Polysaccharides on Immunodeficiency and Reproductive Genotoxicity Induced by Cyclophosphamide in Mice

HE Jia-tao，SU Ze-chun，SUN Dong-fang et al

（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract [Objective]To study the effect of immunosuppression，reproductive ability and genetic stability of mussel crude polysaccharides on cyclophosphamide-induced immunosuppression in mice.[Method]Mice were given cyclophosphamide intragastrically to establish immunosuppressive mice model，while polysaccharide from common mussel were extracted by papain was fed with mice by intragastric administration.After 7 days，effects of mussel crude polysaccharides of immunocompromised mice was studied by detecting many indices，such as body weight，organ indices，blood routine index，bone marrow cell micronucleus rate and sperm aberration rate.[Result] Compared with control group，the model group mice significantly reduced the body weight，significantly decreased the thymus index level by 34.6% ，significantly increased cardiac index，the index of intestinal level by 73.4%，43.6%，respectively.The leucocytes，erythrocyte，hemoglobin，platelet，mean corpuscular volume and hematocrit of model group mice were significantly lower than those of control group.The model group mice of the percentage of lymphocytes，intermediate cells and neutrophils was inbalance，the micronucleus rate and sperm aberration rate increased by 17.67 thousandth point， 7.77 percentage point and compared to the control group.Compared with model group，low and high dose groups had different degree of improvement in the above indexes.[Conclusion] A certain dose of mussel crude polysaccharide can improve the immune function of immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide，and alleviate the genetic and reproductive toxicity caused by cyclophosphamide.

Key words Mussel crude polysaccharides;Cyclophosphamide;Immunosuppression;Reproductive toxicity and genotoxicity

基金項目 国家级大学生创新创业训练计划项目（CXXL2018007）;广东省科技厅公益研究与能力建设专项资金项目（2014B020204005）。

作者简介 何嘉桃（1998—），女，广东佛山人，硕士研究生，研究方向：水产品质量安全与营养功能。通信作者，教授，博士，博士生导师，从事水产品质量安全与营养功能研究。

收稿日期 2021-04-23

环磷酰胺广谱抑制癌细胞生长[1]，且价格低廉、效果显著，已广泛应用于临床治疗[2]。但研究发现，服用环磷酰胺会引起一系列副作用，如抑制免疫细胞增殖和免疫器官的正常发育[3]，降低机体的免疫能力;诱导器官组织氧化应激损伤[4];遗传物质发生改变，机体内生殖细胞发生突变[5]。多糖是常用的免疫调节剂[6]。但目前的研究主要集中在植物多糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响，海洋源多糖类的相关研究相对缺乏。

贻贝属双壳软体动物是我国东部沿海地区贝类养殖业中的重要种类[7]。贻贝产量高，富含营养物质，经相关研究表明，贻贝中的活性多糖具有调节免疫[8]、降血脂[9]、抗氧化[10]等作用，但普遍应用效率低下。

评定机体免疫力强弱的指标主要有免疫器官指数、白介素的含量、免疫球蛋白的含量、NK细胞杀伤活性、淋巴细胞活性、血常规等。根据目前已有研究，贻贝多糖对正常小鼠、致敏小鼠具有免疫增强作用[8]，通过测定NK细胞杀伤活性、白介素的含量等指标，确定贻贝粗多糖具有提高环磷酰胺诱导免疫低下小鼠免疫力[11]的作用。但有关于从免疫细胞的组成和数目（血常规指标）等观察贻贝粗多糖的免疫效果以及贻贝粗多糖对生殖遗传毒性作用的相关研究较少。因此，该研究利用贻贝粗多糖灌胃小鼠，对比体重、器官指数、血常规指标、骨髓细胞微核率及精子致畸率的变化，探讨贻贝粗多糖对免疫低下小鼠免疫细胞含量、组成变化及缓解环磷酰胺对机体的生殖遗传毒效应，有助于开发化疗患者治疗过程中配套服用的贻贝多糖保健品，降低环磷酰胺对机体产生的毒副作用，实现贻贝的高值化利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

贻贝（湛江海鲜市场）;环磷酰胺（深圳安泰生物科技有限公司）;木瓜蛋白酶（上海瑞永生物科技有限公司）;HC2200 型血常规分析仪（中国苏州迈瑞公司）; CKX41型光学显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 贻贝粗多糖的制备和测定。

去壳取贻贝肉，匀浆，冷冻干燥，磨制成粉。用索氏提取法对贻贝粉进行脱脂，得去脂贻贝粉，备用。将去脂贻贝粉过20目筛，按料液比（g∶mL）1∶15配制成溶液，调节温度为60 ℃，pH为7，加入1%木瓜蛋白酶，酶解，升温到99 ℃灭酶20 min。调pH为中性，4 000 r/min离心5 min，取上清，Sevage法除蛋白，浓缩液体，按体积比4∶1（乙醇∶浓缩液）加入95%乙醇醇沉，4 ℃静置12 h，离心，把沉淀冷冻干燥后可得贻贝粗多糖。利用硫酸-苯酚法测定酶解后的含糖量。

1.2.2 实验动物及分组。

15只SPF级别7周龄昆明雄性小鼠，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，在温度（24±2） ℃、湿度（60±10）%的条件下，适应性喂养7 d，随机平均分为5组，每组3只，分为对照组、模型组、贻贝粗多糖组、低剂量试验组、高剂量试验组。

①对照组[蒸馏水，20 mL/（d·kg）];②模型组[环磷酰胺10 mL/（d·kg）+蒸馏水10 mL/（d·kg）];③贻贝粗多糖组[5.0 mg/mL贻贝粗多糖20 mL/（d·kg）];④低剂量试验组[环磷酰胺10 mL/（d·kg）+2.5 mg/mL贻贝粗多糖10 mL/（d·kg）];⑤高剂量试验组[环磷酰胺10 mL/（d·kg）+10.0 mg/mL贻贝粗多糖10 mL/（d·kg）]。连续灌胃7 d，试验期间，小鼠可自由进食进水。

1.3 检测指标

1.3.1 小鼠体重变化和器官指数。

每天灌胃前，称重，观察并记录各组小鼠体重的变化。距离最后一次给药24 h后，摘眼球取血后，脱颈椎处死小鼠，迅速解剖，取出器官，称重，计算出器官指数。

器官指数=脏器质量（mg）/小鼠体重（g）

1.3.2 小鼠血常规指标和免疫学指标。小鼠处死前，摘眼球，取血200 μL到1.5 mL肝素抗凝离心管中，于血细胞分析仪上机检测。

1.3.3 小鼠骨髓细胞微核观察。小鼠脱脊椎处死后，解剖，取胸椎骨，剔除肌肉，用止血钳固定胸椎骨的前端，剪断骨后端，挤血到已有小牛血清的载玻片上，混匀，推片，室温晾干;于甲醇中浸泡15 min，取出，室温晾干;Giemsa染色15 min，冲洗，室温晾干。于10倍镜下选择细胞分布均匀的区域，100倍镜下计数每只小鼠6 000个嗜多染红细胞（PCE）中带微核细胞（MN）数，计算出微核率，微核率以千分率表示。

微核率=微核数（个）/观察细胞数（个）×1 000‰

1.3.4 小鼠精子观察。

小鼠脱脊椎处死后，解剖，取两侧附睾到生理盐水中，混匀，制备精子悬液。吸取精子悬液滴于载玻片上，推片，室温晾干;于甲醇中浸泡5 min，室温晾干;2%伊红水溶液染色1 h，冲洗，室温晾干。

于10倍镜下找到精子重叠少的区域，100倍镜下计数。每只小鼠计数200～500个精子，观察畸形精子数，计算精子畸变率，以百分率表示。

畸变率=畸形精子（个）/观察总精子数（个）×100%

2 结果与分析

2.1 贻贝粗多糖的含量及对免疫抑制小鼠体重的影响

经硫酸-苯酚法测得的含糖量为70%。由表1可知，试验第1天，各组间小鼠体重差异不显著。與对照组相比，灌胃第7天模型组小鼠和连续7 d服用贻贝粗多糖的正常小鼠（贻贝粗多糖组）体重显著下降（P<0.05）。对比模型组，低、高剂量组的体重仍显著偏低（P<0.05）。贻贝多糖降低小鼠体重的现象，与李孟婕等[9]的研究结果一致，其中的机制可能是多糖能促进肠道蠕动[12]，加快机体新陈代谢速度，以及小鼠原本的个体差异，进食进水、精神状态等[13]都会对体重产生影响。

2.2 贻贝粗多糖对免疫抑制小鼠器官指数的影响

器官指数能直观反映外源化合物对脏器的影响[14]，其中胸腺和脾脏指数是评判机体免疫能力的重要指标[15]，通过对比胸腺指数和脾脏指数，反映环磷酰胺对机体先天免疫的损伤。由表2可知，与对照组相比，模型组的胸腺指数显著降低（P<0.05），脾脏指数下降但无显著性差异，肠指数和心脏指数分别显著升高73.4%、43.6%（P<0.05）。林帅等[16-18]等研究发现，同一时期暴露在等浓度的环磷酰胺下，与脾脏指数相比，胸腺指数下降幅度更大，这与该试验结果一致，可能是由脾脏和胸腺的作用功能、组织结构的差异造成，短期摄入环磷酰胺对胸腺氧化应激损伤，导致胸腺萎缩[19]，器官指数显著下降。模型组小鼠的心脏和肠肿大，原因可能是环磷酰胺能提高体内炎性因子水平[20]，出现局部肿胀的现象。对比模型组，贻贝粗多糖组和低、高剂量组的胸腺指数有所上升，肠指数下降，但均无显著差异，心脏指数显著下降（P<0.05）。贻贝多糖经证实有抗炎[21]和抗氧化[10]的效果，结合该试验结果，贻贝粗多糖可能通过降低机体内的炎性因子水平，缓解心脏、肠器官肿胀;能减轻氧化应激对胸腺的损伤，促进胸腺正常生长发育，但具体机制尚不清楚。

2.3 贻贝粗多糖对免疫抑制小鼠血液常规指标的影响

血液中含有大量的免疫细胞[22]，测定机体血液内免疫细胞组成和体表变化是评定机体稳态和免疫能力的指标之一。由表3可知，与对照组相比，模型组小鼠WBC、PLT 、RBC、 MCV、 HCT显著降低（P<0.05），HGB有所下降，但差异不显著（P>0.05），说明环磷酰胺诱导小鼠的免疫细胞数目显著下降，免疫能力降低。对比模型组，灌胃贻贝粗多糖小鼠WBC、PLT 、RBC、HGB、 MCV、 HCT的水平提高，除WBC显著升高外（P<0.05），其他均无显著差异。2个剂量组之间的血液常规指标无显著差异（P>0.05），但总体上看，低剂量组提升效果更好。环磷酰胺并不是靶向药，在攻击肿瘤细胞的过程中，会对骨髓等其他组织造成一定的损伤[23]。骨髓是白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板发育分化的地方，当骨髓遭到破坏，抑制骨髓造血干细胞分化成不同的免疫细胞的进程[24]，减少机体内免疫细胞的数量，降低机体的整体免疫能力。结果表明，贻贝粗多糖能促进免疫细胞的增殖及骨髓抑制状态。

2.4 贻贝粗多糖对免疫抑制小鼠免疫学指标的影响

由表4可知，与对照组相比，模型组LYM显著提高25.7%（P<0.05），MID、GRAN显著下降52.2%、85.7%（P<0.05）。对比模型组，低、高剂量组的MID、GRAN占比升高，LYM下降，差异均无统计学意义。低、高剂量组之间的LYM、MID、GRAN的百分比无显著差异（P>0.05）。说明贻贝粗多糖可以调节LYM、MID、GRAN，且三者之间的比例趋于正常水平，能维持机体免疫功能的稳定。

2.5 贻贝粗多糖对免疫抑制小鼠骨髓细胞微核率的影响

比较不同剂量组之间的嗜多染红细胞的微核率，检测灌胃7 d环磷酰胺在小鼠体内产生遗传毒性的大小[25]以及贻贝粗多糖的缓解作用。由表5可知，在观察同样的细胞总数中，与对照组相比，模型组的微核率提高近10倍。对比模型组，低剂量试验组的微核率降低6.33千分点、高剂量试验组降低10.33千分点。环磷酰胺是烷基化剂，在机体内转化为次级代谢物，生成烷基化DNA、RNA和蛋白质引起DNA单链断裂[26]，遗传物质损伤出现微核异常现象[27]。试验结果表明，贻贝粗多糖可能有效抑制环磷酰胺诱导的致突变作用。

2.6 贻贝粗多糖对免疫抑制小鼠精子的影响

统计畸形精子的数目，检测短期灌胃环磷酰胺引起生殖细胞遗传损伤[28]以及贻贝粗多糖的缓解作用。由表6可知，与对照组相比，模型组的精子畸变率升高7.77百分点，贻贝粗多糖组下降0.55百分点。经过贻贝粗多糖干预后，对比模型组，低、高剂量试验组分别降低精子畸变率2.85、6.68百分点。服用环磷酰胺等化疗药物，会导致性腺功能出现障碍，改变精子的染色体结构，使精子外形异常[29]。该试验结果说明，贻贝粗多糖能降低环磷酰胺对精子的损伤，且高剂量的保护作用效果优于低剂量。

3 结论

该试验研究木瓜蛋白酶提取的贻贝多糖对免疫抑制小鼠的免疫功能、生殖能力和遗传稳定性的作用效果。结果表明，环磷酰胺诱导小鼠白细胞、红细胞等免疫细胞数量显著下降，导致淋巴细胞百分比明显偏高，中性粒细胞百分比明显偏低，说明小鼠体内的免疫平衡紊乱，抑制小鼠固有免疫、细胞免疫能力，提示环磷酰胺不仅对胸腺、脾脏造成损伤，还对生长、发育、分化免疫细胞的器官产生毒作用。服用贻贝粗多糖能降低免疫抑制小鼠心脏、肠器官指数，升高胸腺指数，增加白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板的含量，使淋巴细胞、中间细胞、中性粒细胞的百分比趋于正常，表明贻贝粗多糖可能通过抗炎作用抑制部分器官肿胀，还通过修复环磷酰胺对免疫器官损伤，增强细胞免疫的作用。环磷酰胺诱导精子畸变和微核率升高，补充高剂量的贻贝粗多糖能降低微核率和精子致畸率，说明贻贝粗多糖能缓解环磷酰胺导致的遗传毒性和生殖毒性。该研究探明了贻贝粗多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的作用，为开发贻贝粗多糖免疫调节剂提供了理论参考。

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