浓香型古井桃花曲中产香功能菌的研究

王志强 李兰 汤有宏 李晓欢 姜利

摘要[目的]评估分析浓香型古井桃花曲中的特色产香功能菌株。[方法]从浓香型古井桃花曲中筛选出28株芽孢杆菌，以固态培养基为底物进行单菌产香试验，并进行闻香评价。[结果]试验得出有6株芽孢杆菌发酵后能够产生浓郁的香味，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对这6株芽孢杆菌的发酵产物进行挥发性成分检测，并与古井贡酒中呈香物质进行对比分析，结果表明这些风味物质与白酒中呈香化合物基本一致。[结论]该研究为寻找浓香型古井桃花曲特色产香功能菌及提高白酒质量提供了理论依据。

关键词古井桃花曲；筛选；产香微生物；挥发性成分

中图分类号TS262.3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）19-0090-02

The Study of Aromaproducing Functional Microorganisms in Gujing Liquor Peach Blossom Daqu

WANG Zhiqiang1，2， LI Lan1，2， TANG Youhong1，2 et al

（1.Anhui Gujing Distillery Co. Ltd.， Bozhou， Anhui 236820； 2.Anhui Solidstate Fermentation Engineering Technology Research Center， Bozhou， Anhui 236820）

Abstract[Objective] To evaluate aromaproducing functional microorganisms in Gujing liquor peach blossom daqu. [Method] Twentyeight strains of bacillus that produce flavor compounds were screened out from Gujing liquor peach blossom daqu. Solid state fermentation experiments of these types of bacillus were studied. They were cultured and tested for singlestrain aroma production by smelling the fragrance. [Result] The results indicated that six strains of bacillus were observed to produce rich flavors postfermentation by sensory analysis. The volatile components in fermentation products of the six strains were identified by headspace solid phase micro extractiongas chromatographymass spectrometry （SPMEGCMS）， and then were compared with the flavor compounds in Gujinggong strongflavor liquor. The results showed that these flavor compounds were basically the same with those in strongflavor Gujinggong liquor. [Conclusion] This study provides a theatrical basis for the application of aromaproducing functional microorganisms in Gujing peach blossom daqu and improvement of the quality of Gujinggong liquor.

Key wordsGujing liquor peach blossom daqu；Screening；Aromaproducing microorganisms；Volatile components

大曲的增香功能是由大曲中的產香微生物决定的，为了深入了解浓香型白酒的香味形成机理，进一步提高浓香型白酒的香气品质，就必须对大曲中的产香微生物进行考察[1-3]，确定浓香型白酒的香味化合物主要由哪些菌种产生，在制曲过程中又代谢产生了哪些香味前体物质[4-5]。

近年来科研工作者们对大曲的研究逐渐聚焦到对产香菌的研究上，并取得了较好的成果。朱德文等[6]从酱香型大曲中分离鉴定出一株产香芽孢杆菌；张春林[7]从泸州老窖大曲中分离鉴定出产香细菌；明红梅等[8]从浓香型大曲微生物分离出能产生浓郁香味的X19和J3菌株。该研究选择浓香型古井桃花曲中分离的28株芽孢杆菌类细菌进行固态发酵试验，由技术人员进行感官分析，根据其香味不同，对其进行分类，并对具有特殊发酵味道的菌种进行气质分析，以期评估古井桃花曲中的特色产香功能菌株。

1材料与方法

1.1材料

小麦固态培养基[8]：干燥小麦麦粒破碎为麦沙、麦粉各半，加等量水，浸润18 h后，蒸熟、冷却、打散，称取70 g于250 mL三角瓶中，121 ℃灭菌20 min。营养琼脂培养基，马铃薯培养基（PDA培养基）。

主要仪器：CP-WAX 50CB（50.00 m×0.25 mm×0.20 μm）毛细管柱，SX-70高压灭菌锅（日本，TOMY），MaxQ 485HP振荡培养箱，Agilent 7890A-5975C气相质谱联用仪（GC-MS，配有电子轰击源EI），Agilent PC420固相微萃取仪，CAR/PDMS 75 μm顶空固相萃取头。

1.2方法

1.2.1菌种固态发酵气相色谱分析的前处理。

固态发酵产物：取固态发酵产物10 g，加入70%无水乙醇50 mL浸泡30 min。在低温条件下离心，转速3 000 r/min，离心10 min，取上清液先进行粗过滤再用微孔膜过滤，得滤液，用10 mL移液管准确吸取10 mL滤液，加入0.1 mL内标混标（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸），振荡摇匀，倒入进样小瓶，准备进样。

1.2.2菌种固态发酵气相色谱-質谱联用仪（GC-MS）分析的前处理。

固态发酵产物前处理同“1.2.1”，吸取发酵液50 mL，在低温条件下离心，转速5 000 r/min，离心10 min，取上清液，用移液管吸取滤液8 mL加入到顶空瓶中，称取氯化钠3.0 g加入到顶空瓶中，并加入一颗搅拌磁子，设置磁力搅拌器温度为50 ℃，转速400 r/min，PDMS萃取头顶空萃取30 min。

1.2.3菌株的代谢产物分析方法。

1.2.3.1气相色谱分析方法。

气相色谱分析条件：色谱柱温度35 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min程序升温至100 ℃，不保持，再以10 ℃/min升温至195 ℃，保持18 min；载气为氮气，纯度≥99.999%，流速1.0 mL/min；进样量1 μL；进样口温度230 ℃；进样方式为分流进样，分流比60∶1。

1.2.3.2气相色谱质谱联用仪分析方法。

不分流，流速0.9 mL/min；进样口温度 230 ℃；升温程序：35 ℃ 保持4 min，以2 ℃/min升温到60 ℃，不保持，以6 ℃/min 升温到180 ℃，保持15 min。

1.2.4菌种的固态发酵试验。

酵母菌选用YPD培养基、细菌选用营养琼脂培养基分别进行接种活化，分别置于28、35 ℃恒温恒湿培养箱中培养24～48 h。从新鲜斜面上取2环菌种，接种到液体试管（每支试管装液10 mL）中，28或35 ℃静态培养36 h，制成种子液。取细菌种子液接种于固态法培养基中，35 ℃培养箱培养24 h，之后温度上升至45 ℃培养24 h，温度继续上升至55 ℃培养72 h。以未接种的空白培养基作为对照，根据各菌株发酵液中风味成分的数量筛选产风味物质的功能菌种。

2结果与分析

选择芽孢杆菌类的28株细菌进行固态发酵试验。将菌株活化后，接种于小麦固态培养基，放入35 ℃培养箱培养24 h，之后温度上升至45 ℃培养24 h，温度继续上升至55 ℃培养72 h。培养结束后由技术人员进行感官分析。根据感官分析结果，选择有类似大曲香味的发酵样进行气相色谱质谱分析。

选择芽孢杆菌类的28株细菌进行固态发酵试验。55 ℃培养120 h时取出，由技术人员进行感官分析。根据其香味不同，将其分为8类：

①DAL10、BAL36、DAL01酸味，其中DAL10和DAL01酸味更重些。

②BAL44、BAL03、BAL13、BAL12小麦味，味淡。

③BAL16、BAL04、BAL41酸味加霉味，BAL16更重些。

④BAL17、BAL43酸味更重，霉味淡些，但比第3类味重。

⑤DAL07、DAL09馊茶叶味，比4类重，DAL07有臭味。

⑥BAL14、BAL18、BAL47、BAL29、BAL30、BAL46、BAL48、BAL33、BAL25、BAL11、BAL40为一类，味道比其他类重，有糊味，较臭，BAL48糊味更重。

⑦BAL22、BAL49与第6类相似，但有酸味。

⑧DAL06与其他不同，有曲香味，但较淡。

发酵感官分析结束后，挑选具有特殊发酵味道的DAL06、BAL48、BAL16、BAL17、BAL14、BAL22进行了气质分析。结果见表1～6。

菌种固态发酵产物气质分析结果表明，DAL06具有明显的类似大曲发酵过程中的香味，2-羟基丁酮、2，3-丁二醇含量较高，这2类物质约占总香味成分的62.23%；而BAL48

具有焦糊味和酸味，且味道特别大，其分析结果显示种类较多，与DAL06差异很明显，主要的物质是嘧啶类、烷烃类和苯酚类。BAL16固态发酵产物中乙酸、四甲基吡嗪含量较高，这2类物质分别占总香味成分的48.94%、27.16%；BAL17发酵产物中主要含3-羟基-2-丁酮、四甲基吡嗪、2，3-丁二醇等物质，其含量分别占总香味成分的20.96%、51.08%、6.40%。

3结论

大曲是白酒酿造过程中重要的微生物、酶类、香气物质和香气前提物质的主要来源，其质量直接关系到白酒的酒质