蓼蓝组织培养再生体系的建立

周江波 陈家鸿 李会会

摘要[目的]建立蓼蓝组织培养再生体系。[方法]以半野生蓼蓝种子、幼叶和茎段为外植体，探讨不同浓度植物激素配比的培养基对其愈伤组织诱导、继代、分化及生根的影响。[结果]以蓼蓝茎段为外植体进行组培是适宜的；诱导和继代最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L，平均诱导率可达73.33%；分化最佳培养基为6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L，平均分化率可达5167%；生根适宜的培养基为1/2 MS+NAA 0.5 mg/L，生根后移栽成活率达100%。[结论]该研究为优良蓼蓝快速繁殖提供了新的途径，并为其种质资源的保存与利用提供了依据。

关键词蓼蓝；组织培养；茎段；愈伤组织

中图分类号S574文献标识码A文章编号0517-6611（2017）19-0123-03

Establishment of Regeneration System for Tissue Culture of Polygonum tinctorium

ZHOU Jiangbo， CHEN Jiahong， LI Huihui

（College of Environment and Life Science， Kaili University， Kaili， Guizhou 556011）

Abstract[Objective] To establish regeneration system for tissue culture of Polygonum tinctorium. [Method]Its seeds， young leaves and stems were used as explants to explore influences of media with different concentration hormone on callus induction， subculture， differentiation and rooting. [Result] Stems of P. tinctorium were ideal explants. The optimum medium for callus induction and subculture was MS+6BA 10 mg/L+2，4D 2.0 mg/L， the corresponding average induction rate was 73.33%. The optimum medium for callus differentiation was 6BA 10 mg/L +NAA 0.5 mg/L， the corresponding average differentiation rate was 51.67%. The optimum medium for seedlings rooting was 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L. The surviving rate after transplanting attained to 100%. [Conclusion]The study provided a new way for P. tinctorium rapid reproduction，and provided theoretical basis for the preservation and utilization of germplasm resources.

Key wordsPolygonum tinctorium；Tissue culture；Stem；Callus

蓼蓝（Polygonum tinctorium），亦略称为蓝或靛青，为蓼科蓼属一年生草本植物，是自然界中含靛蓝较多的一种植物。蓼蓝被认为起源于印度，后被传入中国、日本及欧洲，被广泛用于天然植物染色[1-2]。目前蓼蓝在我国南北地区均有分布，呈零星栽培或半野生状态[3]。至今蓼蓝仍是一些地区主要天然植物蓝色染料的原材料[4-5]，苗、侗、瑶、布依等少数民族仍在大量使用蓼蓝加工扎染[6]和蜡染民族工艺品[7] 等。另外，蓼蓝还是常用的药用植物，蓼蓝种子和叶的甲醇-乙酸乙酯提取物表现出很强的抗氧化活性和抗癌效应[8]。Yu等[9]报道了蓼蓝发酵的叶片提取物对HIV-1和HSV-1病毒有很强的抗性；Heo等[10]通过体外试验揭示了蓼蓝提取物可有效地抑制癌细胞的增殖；近年，韩国研究人员Park等[11]研究表明，经过超亚处理的蓼蓝叶片有机溶剂提取物对人体的血清白蛋白有更高的抗氧化性和结合能力。

为保护蓼蓝优异种质资源，满足人们对其优质栽培及生产实践的需求，探究蓼蓝高效组织培养再生体系是有效途径之一。目前国内外已有对蓼蓝化学成分、生理功效及药理作用分析等方面的报道，但对其组织培养再生体系的建立鲜见报道。该研究建立了蓼蓝组织培养再生体系，以期为优良蓼蓝快速繁殖提供新的途径，为其种质资源的保存与利用提供依据，并对保留传承和保护民族地区天然植物染料民族传统工艺起到积极作用。

1材料與方法

1.1材料及消毒处理

供试蓼蓝取自贵州省凯里经济开发区觉雅村山坡地（107.97° E，26.59° N），为自然生长的半野生植株。分别选用蓼蓝不同时期种子、幼叶和茎段作为外植体，接种前将外植体在无菌超净工作台上用蒸馏水冲洗干净，在滤纸上沥干，将其转移至已灭菌的50 mL离心管中，用75%乙醇消毒2 min，无菌水清洗3次，再将3种外植体分别用0.1%的HgCl2溶液消毒处理10～12 min，无菌水冲洗5次，转移至滤纸上沥干，待接种。

1.2培养条件

以MS为基本培养基，分别添加不同种类和质量浓度的植物激素，筛选蓼蓝组织培养生长各阶段的最佳培养基。诱导和继代培养基中添加不同配比的6-BA、2，4-D，6-BA质量浓度分别设为0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L；2，4-D质量浓度分别设为0、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L，培养基pH 5.8，广口瓶中接种后于培养室暗培养，室内培养温度为（25±1） ℃，湿度为50%～60%。分化培养基中的植物激素用6-BA和NAA组合，6-BA质量浓度分别设为1.0、2.0、3.0 mg/L；NAA质量浓度分别设为0、0.5、1.0 mg/L，光照周期为16 h/8 h（光/暗）。每个处理接种20个（块），3次重复。

1.3生根和移栽

蓼蓝的生根培养，以1/2 MS为基本培养基，分别添加质量浓度为0、0.5、1.0 mg/L的NAA。待生根至1～2 cm后炼苗1～2 d，移栽至湿润的营养土钵中生长。

1.4数据分析

数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析。

2结果与分析

2.1不同外植体对蓼蓝诱导愈伤组织的影响

对蓼蓝种子、幼叶和茎段3种外植体分别消毒处理后，将其接种在诱导培养基上，暗培养一段时间后观察各自的长势。有些種子萌发出芽（图1a），难以诱导出愈伤组织；幼叶诱导的愈伤组织较少且白色疏松（图1b）；6 d后有些茎段两端开始膨大，生长成纺锤体形状，逐渐生长形成淡黄色致密的愈伤组织，茎段诱导的愈伤有些呈黄色致密结构，有些部位呈浅绿色，长势较为缓慢（图1c）。对外植体消毒处理相比较，种子颗粒过小，有壳，来自半野生植株的种子无菌操作污染率相对较高；幼叶取材时效性强；而茎段虽然诱导愈伤组织生长缓慢，但愈伤组织活力较好，且茎段消毒处理容易操作，效果较好。可见茎段是蓼蓝诱导愈伤组织合适的外植体。

2.2不同培养基配比对蓼蓝愈伤组织诱导的影响

从表1可看出，植物生长激素6-BA和2，4-D都对茎段愈伤组织的诱导起促进作用，2，4-D浓度对诱导效果有更大的影响，愈伤组织在添加2，4-D的培养基上发生得快，最早在诱导6 d后茎段两端开始出现愈伤。不添加2，4-D时，茎段几乎难以诱导出愈伤，而是形成不定芽。当2，4-D浓度为0～20 mg/L时，其对茎段愈伤组织的发生起促进作用，同时出芽率有所下降。茎段在培养基9（MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L）中诱导培养，平均诱导率达到最大（7333%），且与其他培养基中的平均诱导率分别在0.05和0.01水平差异显著。当2，4-D浓度继续增大时，其愈伤组织受到了抑制，平均诱导率开始下降。6-BA浓度增大时，其对平均诱导率均有所抑制。综合比较，适合蓼蓝茎段诱导愈伤组织的培养基配方为MS + 6-BA 1.0 mg/L + 2，4-D 2.0 mg/L。

将诱导得到的愈伤组织转至继代培养基生长，继代培养基采用与初代相同的诱导培养基配比（培养基9）。愈伤组织经过继代培养块状增大，生长致密，呈一簇一簇的颗粒状，颜色淡黄，生长旺盛。也有极少量愈伤块出现褐化，少量颜色变得浅白，失去了分化再生出芽的能力。

2.3不同培养基配比对蓼蓝愈伤组织分化的影响

为了获得蓼蓝再生植株的主苗，对继代培养后的愈伤组织转入分化培养基进行光照培养。经过28 d的培养，愈伤组织开始出现绿点（图2a），致密饱满，培养63 d后大部分胚性愈伤组织分化出苗（图2b）。

由表2可知，随着6-BA浓度的升高，分化率先增加，后逐渐降低，NAA浓度为0.5 mg/L时，分化率相对较大，愈伤组织平均分化率达51.67%，与其他培养基中的平均分化率分别在0.05和0.01水平上差异显著。结果表明，适合蓼蓝愈伤组织分化的培养基是6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L。

2.4生根与移栽

蓼蓝愈伤组织分化的芽在1/2 MS + NAA 0.5 mg/L培养基中培养5～8 d开始生根，生根率达100%（图3a），平均根长达1.8 cm，即可移出培养瓶炼苗1～2 d（图3b），移栽至湿润的钵土中种植（图3c），补充水分以保温保湿。移栽后5 d对幼苗统计，定植成活率达100%。移栽21 d后，幼苗开始长出多片新叶，保持良好的生长优势。

3讨论与结论

以天然染料植物为材料进行组织培养，不仅有利于保护山地少数民族地区植物的遗传多样性，民族药用植物资源的可持续利用，而且可为优良种质资源鉴评和品种改良奠定基础。贵州黔东南地处苗岭山区，属中亚热带季风湿润气候区，具有冬无严寒，夏无酷暑，雨热同季的特点，年平均气温14～18 ℃，适宜蓼蓝种植生长。蓼蓝可持续利用对苗岭山区少数民族文化的传承有着重要的意义。但当前蓼蓝野生或半野生分布零散，产量低，生长速度缓慢，种质资源良莠不齐，很大程度上制约了蓼蓝在民族工艺上的规模化应用，而组织培养是蓼蓝快繁的有效技术途径之一。该试验比较选用了蓼蓝茎段为外植体进行组织培养，建立了蓼蓝组织培养再生体系，从外植体的消毒及其愈伤组织的诱导、继代增殖、分化再生及生根培养各个阶段，比较分析了其生长适宜的最佳培养基配方。

蓼科植物以不同的外植体来进行组织培养目前均有报道，其中以茎段和幼叶作为外植体较为常见。柴瑞娟等[12]比较了荞麦的幼茎和幼叶作为外植体诱导愈伤组织，结果表明幼茎在偏软的培养基上诱导愈伤组织较为理想。刘明珍等[13]以酸模叶蓼带腋芽茎段作为外植体进行离体培养，研究了进一步诱导生成完整植株的快繁技术。刘晓东等[14]以香蓼带芽茎段为外植体，初步建立了香蓼组织培养快繁体系。该试验中蓼蓝种子较小，消毒接种易受污染，往往需去宿被再消毒而使操作效率降低，幼叶取材又受时间限制。综合考虑，选用蓼蓝茎段作为外植体较为适合，茎段取材便捷，便于消毒，易操作，污染率低，且愈伤组织诱导率较高。

该研究表明，植物激素6-BA、2，4-D均能促进愈伤组织的诱导，其中2，4-D浓度对愈伤组织的诱导有着更大的影响，且表现出明显的质量浓度效应，适宜的植物激素浓度对愈伤组织起促进作用，而超过一定浓度，起抑制作用。这一结果与王鹏姬等[15]对蓼科荞麦植物研究结果一致。刘晓东等[14]诱导香蓼腋芽诱导的最适培养基为MS + 6-BA 20 mg/L + NAA 0.1 mg/L，刘明珍等[13]比较筛选出酸模叶蓼最适的增殖培养基为 MS + NAA 1.0 mg/L + 6-BA 005 mg/L。该试验中蓼蓝茎段诱导愈伤组织的最佳培养基配方为MS + 6-BA 1.0 mg/L + 2，4-D 2.0 mg/L，愈伤组织分化的最佳培养基为6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L。综合比较来看，6-BA、2，4-D在蓼蓝愈伤组织诱导、增殖方面有着更大的影响，NAA在对蓼蓝分化、生根方面有着很大的影响。

蓼蓝愈伤组织的诱导及再生体系研究的建立，有望改善常规种植产量低、生长速度慢，少数民族地区需求量大的矛盾，可为蓼蓝种质资源保护鉴评和品种遗传改良提供物质基础，并对利用天然植物染料的民族工艺起到保护和传承的作用。

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