莱茵衣藻玀APK4基因RNAi载体的构建及鉴定

王子贺 邓晓东 张阳 费小雯 ��

摘要[目的] 构建莱茵衣藻2A38的MAPK4基因的RNAi载体。 [方法]提取莱茵衣藻细胞总RNA，利用PCR扩增出编码MAPK4的基因片段，用基因工程技术将MAPK4基因片段连接载体pMD18-T上，经过2次不同的双酶切后，与RNAi中间载体pT282连接，最后连接到干涉载体pMaa7IR/XIR上，用酶切及测序鉴定MAPK4基因RNAi载体并转化莱茵衣藻。 [结果]经限制性内切酶酶切及测序鉴定，证实为重组质粒，并且该重组载体可在莱茵衣藻中表达。 [结论]构建的MAPK4基因RNAi载体结构正确，为进一步利用RNAi技术使MAPK4基因沉默表达，研究MAPK4在莱茵衣藻中的生物学功能奠定了试验基础。

关键词莱茵衣藻；MAPK4基因；RNAi

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2017）19-0126-04

Construction and Identification of MAPK4 Gene RNAi Vector of Chlamydomonas reinhardtii

WANG Zihe1， DENG Xiaodong2， ZHANG Yang1， FEI Xiaowen1*

（1.College of Basic Medicine and Life Science，Hainan Medical College， Haikou， Hainan 571101；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101）

Abstract[Objective] To construct a MAPK4 gene RNAi vector of Chlamydomonas reinhardtii 2A38. [Method] Total RNA was extracted from C. reinhardtii， and the MAPK4 gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction（PCR）. By using gene engineering technique， C. reinhardtii MAPK4 gene was inserted to pMD18T vector. The forward and reverse fragments ，which were obtained by two different double enzyme digestion of pMD18T vector， were inserted into the RNAi intermediate vector pT282. The invertedrepeat fragment was digested by enzyme EcoRI and linked to the vector pMaa7IR/XIR.The recombined plasmid was identified by digestion and sequencing. [Result] Through restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing identification， the recombinant vector was successfully constructed， it could be expressed in C. reinhardtii. [Conclusion] The constructed MAPK4 gene RNAi vector has correct structure， which laies the foundation for using RNAi technique to silence the gene expression and further research on MAPK4 biological function in C. reinhardtii.

Key wordsChlamydomonas reinhardtii；MAPK4 gene；RNAi

铁是自然界生物质生长和繁殖不可缺少的元素，在植物中，铁是最早发现的必需营养因子。铁直接或间接参与植物光合、呼吸作用中的光合磷酸化和氧化磷酸化，固氮作用及硝酸盐还原过程中的电子传递，又参与植物的细胞分裂，影响叶绿体的组成[1-2]。在哺乳动物中，铁的主要作用是运载和储存体内的氧和二氧化碳，参与细胞色素氧化酶等动物生长所必需的活化因子的组成，最重要的是参与血红蛋白和肌红蛋白的组成[3]。笔者所在实验室以莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）为研究对象，在缺铁应答突变体库中筛选得到一个突变体mu9， 已经证明该突变体Femu9p基因的缺失是造成报告基因活性丧失的原因，其编码蛋白含有丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK）结构域，在缺铁的条件下可以诱导表达[4]。MAPKKK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信号转导通路中的组成部分，故预测MAPK信号转导通路参与铁的调控。MAPK存在于真核生物中，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，MAPK级联信号转导通路由MAPK、MAPKK、MAPKKK组成，其信号转导过程中，MAPKKK、MAPKK、MAPK通过依次磷酸化作用而被激活[5]，参与介导细胞的生长发育、分裂、分化和凋亡等生理活动[6]。该试验通过RT-PCR扩增莱茵衣藻MAPK4基因干涉片段，并通过连接、转化等重组方法，构建MAPK4基因的干涉载体，为下一步研究MAPK4基因在萊茵衣藻铁代谢机制中的作用奠定试验基础。

1材料与方法

1.1材料

藻株、菌株及载体：所使用的莱茵衣藻2A38是由购自美国杜克大学衣藻中心的莱茵衣藻 CC425改造而成；E.coli DH5α菌株、载体pT282、RNAi载体pMaa7IR/XIR是由笔者所在实验室提供；PMD-18T 载体购自TaKaRa 公司。

试剂与仪器：PCR 试剂盒（海南微氪生物科技有限公司），巴龙霉素、5-氟吲哚、L-色氨酸、Trizol、DEPC、T4 DNA连接酶、质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒和PCR 产物回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司），HindIII和BamHII等限制性内切酶、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 试剂盒（TaKaRa），Tgradient梯度PCR 仪（Biometra， GER），高速冷冻离心机，涡旋器，恒温摇床，六一电泳系统，恒温培养箱。

1.2方法

1.2.1

总RNA的提取及反转录。 将2A38藻株接于50 mL的TAP液体培养基中培养至对数期，用Trizol法提取莱茵衣藻的总RNA，再用大连宝生物公司的M-MLV反转录试剂盒合成cDNA。

1.2.2莱茵衣藻MAPK4基因干涉片段的扩增。 根据 Phytozome 数据库公布的MAPK4（Cre17.g745447）的序列，设计用于扩增干涉片段的引物为 F-GCACAGCCTCATAGGAAAGG/R-CCAATCACTGTGTGCAGGTC。通过PCR扩增用于构建RNA载体的干涉片段，反应体系为cDNA模板1 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL， 1×Mix 12.5 μL，Taq酶0.5 μL，DMSO 1 μL ，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3干涉片段与载体pMD18-T连接。 将扩增得到的目的片段回收并纯化，与载体pMD18-T连接（图1a），连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞，挑取单克隆菌落培养后进行菌液PCR鉴定，经测序验证正确，得到pMD-18T-MAPK4。

1.2.4正向片段与载体pT282连接。 用HindIII和BamHII分别进行双酶切 pMD-18T-MAPK4和中间载体pT282，切胶回收酶切后的MAPK4正向片段和线性化载体pT282并连接（图1b），转化E.coli DH5a感受态细胞，挑取单克隆菌落，提取质粒，并用HindIII和BamHII双酶切鉴定重组质粒，得到pT282-MAPK4正向片段质粒。

1.2.5反向片段与载体pT282连接。用XbaI和SalI 双酶切pMD-18T-MAPK4 和 pT282-MAPK4正向片段重组质粒，切胶回收MAPK4反向片段和线性化的pT282-MAPK4 正向片段载体并连接，转化E.coli DH5a感受态细胞，挑取单克隆菌落，提取质粒，并用XbaI和SalI双酶切鉴定。再用EcoRI酶切鉴定，得到由MAPK4干涉片段正反方向插入的中间载体pT282-MAPK4（图1b）。

1.2.6

正反向重复片段与载体pMaa7IR/XIR连接。用EcoRI酶切中间载体pT282-MAPK4和RNAi空载体pMaa7IR/XIR，回收MAPK4正反重复片段和线性化的pMaa7IR/XIR 载体并将回收的载体进行去磷酸化处理，然后连接（图1c），转化E.coli DH5a感受态细胞，挑取單阳性克隆，提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定，得到pMaa7IR/MAPK4IR干涉表达载体，并测序鉴定。

1.2.7转化莱茵衣藻及转化后鉴定。 将莱茵衣藻2A38在TAP液体培养基中于25 ℃200 r/min、全光照的条件下培养至对数期。用玻璃珠法[7]将pMaa7IR/MAPK4IR干涉载体及空载体pMaa7IR/XIR分别转化莱茵衣藻，将转化后的藻细胞于50 mL离心管，避光温育过夜。3 000 r/min，离心5 min收集藻细胞，涂布于含有5 μg/mL巴龙霉素的TAP固体培养基上，全光照培养6～7 d。挑选单克隆藻株，接种于含5 μmol/L 5-氟吲哚、1.5 mmol/L L-色氨酸的TAP固体培养基上筛选，挑取筛选后的单克隆藻株，进行目标基因MAPK4表达丰度分析。

1.2.8

转基因藻株MAPK4基因表达丰度检测。 挑选3个转基因藻株于液体TAP培养基中培养至对数期，提取总RNA并反转录为cDNA，根据SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 试剂盒说明书进行操作。qPCR引物为F-GCACAGCCTCATAGGAAAGG/R-CCAATCACTGTGTGCAGGTC。反应体系为cDNA模板2 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，SYBR Premix Ex TaqTM 7.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.3 μL，ddH2O补足至15 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性 1 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延伸1 min；4 ℃保温。每个样品设3个重复。空载体pMaa7IR/XIR转基因藻为对照，18S rRNA为内参，数据采用2-ΔΔCt法分析。

2结果与分析

2.1莱茵衣藻MAPK4基因干涉片段的扩增

以莱茵衣藻总RNA反转录成的cDNA 为模板，以RNAi片段的特异性引物来扩增（片段大小273 bp），用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，在250～500 bp出现特异性条带，与预期目的片段大小一致（图2）。

2.2pMD-18T-MAPK4菌落PCR鉴定

挑取单阳性克隆的菌落当模板进行菌液PCR，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，在250～500 bp处有条带，且与原先的目的片段大小一致，经测序正确（图3）。

2.3RNAi正、反向片段的获得

用2组酶分别双酶切pMD-18T-MAPK4，将正向片段和反向片段从质粒上切下来，然后再进行胶回收纯化目的片段，并与酶切处理过的pT282连接。酶切质粒pMD-18T-MAPK4与pT282所用2组酶分别为 HindIII 和 BamHII（此组酶切下的片段定义为正向片段）、XbaI和 SalI（此组酶切下的片段定义为反向片段）。

2.4正、反向片段与载体pT282连接鉴定

用HindIII和BamHII进行双酶切pT282-MAPK4正 向片段重组质粒，电泳分析，在100、250 bp处有条带，表明正向片段已成功地连接到载体pT282上；用XbaI和SalI 双酶切pT282-MAPK4正反向片段重组质粒，电泳显示，大小与预期大小一致，表明反向片段已成功地连接到载体pT282上（图5）。

2.7干涉载体转化莱茵衣藻后检测结果

提取培养至对数期藻细胞的总RNA，反转录成cDNA，用qPCR法检测莱茵衣藻MAPK4基因mRNA的表达量。由图8可知，3个干涉载体pMaa7IR/MAPK4IR转基因藻菌与空载体pMaa7IR/XIR转基因藻菌相比，MAPK4的mRNA表达量分别下降了7960%、83.40%、74.70%，说明沉默效果较好。

3讨论

目前，基因敲除已经成为研究基因功能不可缺少的工具，而RNA干涉技术又是比较理想的可以使目的基因沉默的工具。RNA干涉（RNA interference，RNAi）是指利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型的技术[8]，其已经应用于基因功能研究、疾病治疗和药物开发与应用等方面[9]。

与铁代谢相关的MAPK的报道主要集中在人类癌细胞

的研究方面。研究发现缺铁将导致肺癌细胞、黑色素瘤细

胞、神经母细胞瘤细胞有丝分裂中断，并诱导这些细胞凋亡，

所以目前临床上采用铁螯合剂desferrioxamine（DFO）或Dp44mT治疗上述癌症[10-12]。缺铁信号的转导可通过ASK1（MAPKKK）激活JNK和p38MAPK级联途径诱导癌细胞凋亡[13]。除了在癌细胞研究方面，在植物、微藻和酵母的铁代谢调控研究领域，对MAPK信号转导通路参与铁代谢的报道还不多。

综上所述，有必要研究MAPK4在莱茵衣藻缺铁应答调控机制中的作用。该研究扩增莱茵衣藻MAPK4基因的干涉片段且成功构建MAPK4-RNAi载体，并转入莱茵衣藻里，为进一步研究MAPK4在莱茵衣藻缺铁应答调控中的作用和生物学功能奠定了试验基础。

参考文献

[1] 周晓今，陈茹梅，范云六.植物对铁元素吸收、运输和储存的分子机制[J].作物研究， 2012， 26（5）：605-610.

[2] JEANFRANOIS B， DUBOS C，GAYMARD F.Iron nutrition， biomass production， and plant product quality[J].Trends in plant science， 2015， 20（1）：33-40.

[3] 张玉超，沈媛媛，晏向华，等.哺乳动物铁稳态分子机制研究进展[J].中国细胞生物学学报， 2011，33（11）：1179-1190.

[4] LI Y J， DENG X D， YANG J H，et al.A putative protein kinase Femu9p contributes to the iron deficiencyinducible expression of ‘FOX1 gene in Chlamydomonas reinhardtii[J].Australian journal of crop science， 2012， 6（12）：1724-1731.

[5] 周志琦，刘强.真核生物的MAPK级联信号传递途径[J].生物化学与生物物理进展，1998，25（6）：496-503.

[6] 陳建勇，王聪，王娟，等.MAPK信号通路研究进展[J].中国医药科学，2011，1（8）：32-34.

[7] 黄非，黄秦，黄敏，等.莱茵衣藻玻璃珠法快速转化检测体系的建立[J].四川大学学报（自然科学版）， 2008， 45（3）：694-698.

[8] FIRE A，XU S，MONTGOMERY M K， et al.Potent and inerference by stranded RNA in Caenothabdetols elegans[J].Nature， 1998，391：808-811.

[9] 赵雪萌，余祖江.基因沉默的工具-RNA干扰技术的研究进展[J].河南医学研究，2015，24（1）：74-75.

[10] BRODIE C， SIRIWARDANA G， LUCAS J， et al.Neuroblastoma sensitivity to growth inhibition by deferrioxamine：Evidence for a block in G1 phase of the cell cycle[J].Cancer rresearch， 1993， 53（17）：3968-3975.

[11] BUSS J L， TORTI F M， TORTI S V.The role of iron chelation in cancer therapy[J].Current medicinal chemistry， 2003， 10（12）：1021-1034.

[12] HILETI D， PANAYIOTIDIS P， HOFFBRAND A V.Iron chelators induce apoptosis in proliferating cells[J].British journal of haematology， 1995， 89（1）：181-187.

[13] YU Y， RICHARDSON D R.Cellular iron depletion stimulates the JNK and p38 MAPK signaling transduction pathways， dissociation of ASK1-thioredoxin， and activation of ASK1[J].Journal of biological chemistry， 2011， 286（17）：15413-15427.