万寿菊对烟草根结线虫的杀线活性

李晓飞 王云民 徐成龙 张加建

摘要[目的]探究万寿菊不同组织粗体物和α-三联噻吩的杀线活性。[方法]以线虫拮抗植物万寿菊为试验材料，烟草根结线虫为靶标，分别测定和比较了不同浓度万寿菊各部分组织粗提物的杀线活性、万寿菊各部分组织粗提物中α-三联噻吩的含量以及α-三联噻吩标准品的杀线活性。[结果]万寿菊的各部分组织粗提物中，叶和花的杀线活性较高；万寿菊中起主要杀线作用的活性物质不是α-三联噻吩。[结论]试验结果为寻找烟田中环境友好型杀线虫剂的研究与应用提供了理论依据。

关键词万寿菊；烟草；根结线虫；杀线活性；α-三联噻吩

中图分类号S435.72文献标识码A文章编号0517-6611（2017）19-0136-02

Nematicidal Activity of Marigold against Tobacco Rootknot Nematode

LI Xiaofei， WANG Yunmin， XU Chenglong et al

（Xiangyun Branch of Dali Tobacco Company in Yunnan Province， Xiangyun， Yunnan 672100）

Abstract[Objective] The aim was to explore the nematicidal activity of the extracts from the different organs of marigold and αterthienyl. [Method] Based marigold as experiment material and tobacco rootknot nematode on targets， we determined the nematicidal activity of extracts from the different organs of marigold， the content of αterthienyl from the different organs of marigold and the nematicidal activity of αterthienyl nematodes， respectively. [Result] The extracts from the leaves and flowers of marigold had higher nematicidal activities， and αterthienyl was not the main nematicides substance of marigold. [Conclusion] The results provide theoretical basis for the research and application of environmental friendly nematicides.

Key wordsMarigold；Tobacco；Rootknot nematode；Nematicidal activity；αterthienyl

据报道，目前云南省已有多个地方发生烟草根结线虫病害，且造成了严重损失[1-4]。根结线虫种群增长迅速、防治困难，且其危害多、易传播、多寄主、顽固且隐蔽，故其造成的危害已日趋严重，对烟草也构成了严重威胁[5]。化学防治一直是被应用较广泛的一种防治根结线虫病害的方法，虽然其具有很好的杀线效果，但由于其毒性高，既影响人类健康，又会带来一系列副作用，如破坏生态平衡、造成次要病害猖撅、药剂残留造成水土污染、引起人畜中毒、抗性丧失等，所以寻求高效、无公害、可持续的方法逐渐成为根结线虫综合防治的热点[6-8]。

很多研究表明，利用抗线虫植物，将其与易感病植物进行轮作或者间作等其他方法，能够很有效地对根结线虫病害进行防控[9]。目前，已有多种作物被报道具有抗线或杀线作用，如菊科类的万寿菊等[10-11]。有研究表明，将番茄和万寿菊进行轮作，番茄的产量可以提高50%以上[12]。笔者通过对万寿菊杀线活性的研究探讨了烟草根结线虫病的生物防治，以期为寻找烟田中环境友好型杀线虫剂的研究与应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

供试植物万寿菊（Tagete erecta）采自云南省大理州祥云县农田，在生长茂盛时采集，烘干粉碎备用。

供试线虫为烟草根结线虫，采自云南省祥云县感病烟草根部，经分离鉴定为爪哇根结线虫（M.javanica）。

1.2方法

1.2.1根结线虫的培养。

选取感病严重的烟草根，洗净，打碎，过200目和500目筛，得线虫卵块悬浮液，置于温箱中25～30 ℃下培养4～5 d，得爪哇根结线虫2龄幼虫，用于试验。

线虫死亡鉴别：线虫死亡时，身体通常呈僵直、螺旋形或弯曲呈弓状，而活线虫通常会扭动或弯曲。线虫偶尔也会有假死现象，要完全确定或判断线虫死亡有困难时，可以将线虫置于清水或2%氯化钠溶液中，2 min后再观察。

1.2.2万寿菊各部分组织粗提物的提取。

分别取万寿菊根茎叶花的干燥粉末500 g，用10倍体积的75%乙醇重复超声提取3次，每次48 h，合并提取液并蒸干，取一定量万寿菊根茎叶花的粗提物分别配制成浓度为50、25、10 mg/mL的溶液进行杀线活性测定，每个浓度设3个重復对照，另设无菌水作为空白对照，每个样品溶液和对照溶液中分别都加入含100条左右线虫的悬浮液。36 h后统计线虫死亡率。

1.2.3α-三联噻吩标准曲线的制作。

称取α-三联噻吩晶体0.1 g，用氯仿稀释成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 μg/mL的系列标准溶液，另设空白对照。在紫外分光光度计上于352 nm波长处测定其吸光度，以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为y=94.343x+0.266 2，R=0.999 2，样品溶液的浓度在0.01～1.00 μg/mL时与吸光度成良好的线性关系。

1.2.4万寿菊根茎叶花粗提物中α-三联噻吩含量的测定。

分别称取1 g万寿菊根、茎、叶、花的粗提物，用氯仿配制成相关溶液后稀释30倍，于紫外分光光度计上352 nm波长处测定其吸光度，再根据α-三联噻吩标准方程计算各部分组织粗提物中α-三联噻吩的含量。

1.2.5α-三联噻吩标准品的杀线活性测定。

试验分为两大组：一组是经过太阳光活化的α-三联噻吩对线虫的活性测定；一组是未经光活化的α-三联噻吩对线虫活性影响的测定。2组试验的步骤设计相同，步骤如下：称取α-三联噻吩标准品0.03 g溶于10 mL 95%乙醇，加600 μL Tween-20助溶，此时α-三联噻吩的浓度为0.003 g/mL，取该浓度的标准品溶液5 mL装于有盖的塑料瓶中，置于太阳光下活化，其余5 mL避光保存。4 h后，分别从经过光活化和未经光活化的溶液中取500、250、100、75、50、25 μL，置于盛有2 500、2 750、2 900、2 925、2 950、2 975 μL无菌水的培养皿中，光活化和未经光活化的试验组每个浓度分别设置3个重复，则此时三联噻吩的浓度为500、250、100、75、50、25 μg/mL，另设含有500 μg/mL样品中等浓度乙醇和Tween-20的无菌水作为对照组，无菌水作为空白对照，最后在每个培养皿中加入线虫100条左右，36 h后统计线虫死亡率。未经光活化的α-三联噻吩的杀线活性测定过程皆在避光环境中进行。

2结果与分析

2.1万寿菊不同组织的杀线活性

同一植物不同部位所含物质的种类以及同一物质含量的不同都会导致不同部位的提取物具有不同的药理活性或者生物活性。试验结果显示，以万寿菊不同组织不同浓度的粗提物溶液培养线虫，36 h后统计线虫死亡率发现，万寿菊各部分组织粗提物对根结线虫的毒杀活性大小顺序为花、叶、根、茎，且在一定范围内，浓度越高，粗提物的杀线效果也越好，其中当粗提物浓度为50 mg/mL时，花和叶的粗提物溶液中线虫的校正死亡率分别在90%和80%以上，而根中线虫的校正死亡率仅超过20%，茎中线虫的校正死亡率则在10%以下（表1）。

2.2α-三联噻吩的杀线活性及万寿菊各组织粗提物中α-三联噻吩的含量

万寿菊在很早就被国内外多名学者证实其组织提取物具有较好的杀线作用，α-三联噻吩一直是其中争议较大的一个物质，有研究者证明α-三联噻吩的杀线活性需要光的活化，故该研究分别测试了经过光活化和未经光活化的α-三联噻吩的杀线活性。结果表明，光活化和未经光活化的α-三联噻吩对根结线虫都有一定的生物活性，光活化确实能提高α-三联噻吩的杀线效果，但效果并不明显，其中光活化和未经光活化的α-三联噻吩对线虫的致死中浓度分别为312.5和431.2 μg/mL（表2）。

万寿菊各部分组织的杀线活性物质是否是α-三联噻吩，通过检测各组织中α-三联噻吩的含量即可验证，故该研究通过紫外分光光度法检测万寿菊各组织粗提物中α-三联噻吩的含量。结果显示，万寿菊各部分组织粗提物中α-三联噻吩含量大小依次为根（90.15 μg/g）、茎（50.23 μg/g）、叶（28.25 μg/g）、花（27.93 μg/g），这和万寿菊各部分组织粗提物的杀线活性大小几乎呈相反的趋势，且通过计算发现，当浓度为50 mg/mL，对线虫的致死率在80%以上时，花和叶的粗提物对应试验浓度中所含有的α-三联噻吩的量分别仅为1.40和1.41 μg/mL，远远小于α-三联噻吩标准品的致死中浓度，在该浓度下，α-三联噻吩是几乎没有杀线效果的。故推测，α-三联噻吩虽具有一定的杀线效果，但万寿菊中起主要杀线作用的物质应该不是α-三联噻吩。

3结论与讨论

万寿菊的花一直被认为对烟草根结线虫病具有较好的杀线活性[13]，但实际生活中，万寿菊花一般用于提取叶黄素，已经得到了较好的应用。该试验结果显示，万寿菊叶的粗提物和花的提取物几乎具有同等的杀线效果，而实际应用中，叶一般都会被同秸秆等一起焚烧，不仅污染环境，也造成了资源的极大浪费，因此在烟田根结线虫的生物防治中，充分利用万寿菊叶的杀线活性也将具有很好的应用前景。同时发现并研究万寿菊叶中起主要作用的活性物质及其作用机制，不仅能够充分利用万寿菊叶的杀线作用，同时也能够为相关活性物质的工业合成提供一定的理论依据。

万寿菊一直是国内外学者研究较多的具有较好杀线效果的植物。关于其中究竟哪一种物质在起主要杀线作用一直存在较大争议[14-15]，一些研究者认为α-三联噻吩是其中的主要杀线物质，但该研究结果显示，α-三联噻吩并不是万寿菊中起主要杀线作用的活性物质。在该研究中，通过多次活性试验测定发现，当万寿菊粗提物对线虫的浸泡时间达36 h时，其对线虫的作用效果已基本不会再增强，36 h时的线虫死亡率已基本能够说明粗提物对线虫的毒杀效果，且由于线虫的生活周期较短，一般从孵化后7 d其活性就会逐渐降低，故该研究将线虫死亡率统计时间定为浸泡36 h，而认为α-三联噻吩是万寿菊中的主要杀线物质的Uhlcnbrock在研究中对线虫的死亡率统计时间持续了6 d，且其统计方法阐述较为模糊，其并未说明統计的是线虫的校正死亡率还是总死亡率，所以其统计的线虫死亡原因究竟是由于提取物所致，还是时间的影响，有待进一步研究。实际万寿菊在起杀线作用时，其中的α-三联噻吩是否很好地受到了光的活化而发挥了杀线效果，也无法得到验证。杨秀娟等[14]研究表明，以乙醇、水等大极性溶剂作为提取溶剂所得粗提物的杀线活性要远远大于小极性溶剂提取物，而α-三联噻吩等噻吩类物质多为小极性物质，是很难溶于乙醇等大极性溶剂的，且万寿菊组织中，α-三联噻吩在花和叶中的含量是很少的，根中含量最高，而万寿菊花的杀线效果最好，这在该研究中也得到了验证，所以这和一些研究者认为万寿菊中起主要杀线作用的活性物质是α-三联噻吩相矛盾。

后续研究需对万寿菊中的主要杀线活性物质进行分离和鉴定，以其为模板进行人工合成。

参考文献

[1] 朱德慧，白广京.宿州市蔬菜根结线虫病危害、防治现状及可持续治理对策[J].安徽农学通报，2007，13（2）：135-136.

[2] 吴慧平，徐劲峰.安徽省潜山县栝蒌根结线虫发生危害及大田药效试验[J].植物保护学报，2006，33（1）：60-62.

[3] JATALA P.Bioligical control of plantparasitic nematodes[J].Ann Rev Phytopathol，1986，24（1）：435-439.

[4] 雷树明，杨文，吴克军，等.云南桑树根结线虫病的发生危害及防治[J].云南农业科技，2012（3）：20-21.

[5] WHITEHEAD A G.Plant nematode control[M].New York：CAB International，1997.

[6] 董锦艳，李国红，张克勤.真菌杀线虫代谢物的研究进展[J].菌物系统，2001，20（2）：286-296.

[7] 何胜洋，葛起新.南方根结线虫的寄生真菌——虫生轮枝孢菌生物学特性的研究[J].植物保护学报，1987，14（1）：29-32.

[8] 周春娜，吳仕豪，邵庆华，等.浅谈植物寄生线虫生物防治研究进展[J].中国植保导刊，2004，24（8）：12-14.

[9] 郑长英，曹志平，陈国康，等.抗根结线虫砧木嫁接对番茄生长及产量的影响[J].中国蔬菜，2004（4）：37-38.

[10] 赵洪海，武侠，迟晓红.不同番茄品种对根结线虫的感染性测定简报[J].莱阳农学院学报，2004，21（2）：180-181.

[11] 李树庆，韦刚，刘志明.香蕉品种对根结线虫病的抗性鉴定[J].植物保护，2004，30（2）：84-86.

[12] 徐汉虹.杀虫植物与植物性杀虫剂[M].北京：中国农业出版社，2001：333-344.

[13] 赵鸿，彭德良，朱建兰.根结线虫的研究现状[J].植物保护，2003，29（6）：6-9.

[14] 杨秀娟，何玉仙.国外利用杀线植物防治植物寄生线虫[J].世界农业，1998（4）：37-38.

[15] 刘宝法，高汉杰.烟草生产技术研究现状及提高其安全性的途径[J].世界农业，2003，6（9）：47-48.