水稻白穗突变体wp6的发现及研究

从夕汉等

摘要{目的]研究水稻穗部叶绿体发育的分子机制。{方法]本文以籼型恢复系RH003的自然突变体wp6为研究材料，从农艺性状、稻米品质和叶绿素含量比较了突变体和野生型，并以突变体与日本晴、9311杂交构建F2群体来研究wp6的遗传模式。{结果]突变体整株叶片呈绿色，抽穗期至成熟期，穗部白色，穗轴和小梗为绿色。与野生型相比，wp6的生育期、株高、有效穗数、每穗总粒以及每穗实粒略高，而wp6的结实率（66.85%）则远低于野生型RH003的82.40%。成熟期米质分析表明，突变体的外观品质和蒸煮食味比野生型略差。苗期突变体和野生型叶片叶绿素含量差异不大，抽穗期时突变体白穗性状是由于叶绿素a含量低所致。对wp6与正常叶色品种杂交F1、F2代的遗传分析表明，该性状受1对隐性核基因调控。{结论]该研究为wp6基因的定位、克隆和功能研究奠定基礎，也为水稻标记性状育种提供新的资源。

关键词水稻（OryzasativaL.）;白穗突变体;叶绿体;遗传分析

中图分类号S  511文献标识码

A文章编号0517-6611（2018）36-0029-03

随着世界人口的持续增长，特别是随着气候干旱和自然灾害的频繁发生，提高光合效率已经成为作物育种的重要目标{1]。叶绿素（Chlorophyll，Chl）是植物叶绿体内参与光合作用的重要色素，叶绿素合成缺陷突变是一类明显的性状突变。高等植物中叶绿素包括叶绿素a（chlorophylla）和叶绿素b（chlorophyllb）2种，叶绿素生物合成从L-谷氨酰-tRNA到叶绿素a，叶绿素a再经叶绿素酸酯a加氧酶氧化即形成叶绿素b，整个生物合成过程需要15步反应，涉及15种酶，在拟南芥中已分离了27个编码这些酶的基因{2-3]，水稻中有17个编码这些酶的基因。整个合成过程主要分为2个部分：从L-谷氨酰-tRNA到原卟啉Ⅸ（protoⅨ）的生物合成和原卟啉Ⅸ（protoⅨ）到叶绿素的生物合成{4]。叶绿素合成途径中，任何一个基因的突变都可能会导致叶绿素合成受阻，改变其含量，从而形成不同程度和不同表型的叶色变化{5-7]。目前，水稻中已发现和鉴定了160多个关于叶色的突变体，包括黄花、浅绿、白化及紫色等性状{8-10]。与叶片相比，尽管水稻穗部叶绿体色素含量相对要少、光合效率低，但穗部光合作用对水稻产量和品质的影响程度及穗部叶绿体发育的分子机理尚不清晰。有研究表明，在抽穗期对水稻穗部分别套不透明和透明袋，套不透明袋的水稻千粒重和结实率都明显低于套透明袋{11]。另外，在育种方面，标记性状的应用越来越受到重视，穗部突变体的穗部颜色可有效应用于不育系和杂交水稻的品种纯度鉴定，有效降低了机械化制种的成本{12]。

笔者从优良籼型两系恢复系RH003获得1个新的白穗突变体wp6，暂命名为wp6（whitepanicles6），对该新白穗突变体的表型特征、主要农艺性状和稻米品质以及遗传模式进行了观察和分析，旨在为水稻白穗突变体wp6的基因定位、克隆和功能研究以及在育种上的应用奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

白穗突变体wp6系从优良两系恢复系育种材料RH003中获得，已种植多个世代，穗部白化表型等农艺性状在合肥、海南两地都能稳定遗传。突变体整株叶片呈绿色，抽穗期至成熟期穗部白色，穗轴和小梗为绿色，以野生型品种RH003为对照。

1.2wp6表型特征观察及主要农艺性状调查

试验于2016年在安徽省农业科学院水稻研究所国家水稻育种改良分中心（合肥）的网室进行。5月1日播种，5月30日移栽，单本种植，株行距20cm×20cm，采用随机区组设计，田间种植，3次重复，每个小区10行，每行11株，按正常田间肥水管理，及时防治水稻病虫害。根据叶龄，全生育期观察供试材料叶色变化情况，抽穗期之后每隔1d记载穗部颜色。

供试水稻品种成熟后，排除边际效应，分别从每行第3株开始连续取5株叶突变体和野生型晾干考种，测定对照及各处理品种产量及其构成因素，调查生育期、株高、有效穗数、每穗总粒数、每穗实粒数、结实率、千粒重等主要农艺性状。

1.3稻米品质的测定

测定前剔除空秕粒，根据中华人民共和国农业部颁布的标准NY/T593—2013{13]测定米粒的长宽比、垩白率、垩白度和透明度以及稻米的胶稠度和碱消值;直链淀粉含量采用瑞典FOSS流动注射分析仪测定。

1.4光合色素含量测定

采用丙酮浸提的方法提取色素，抽穗期时，取抽穗期RH003和wp6材料的剑叶（完全伸展开）叶片和幼穗，称量约30～200mg后剪碎，置于相应体积的80%丙酮中，室温避光放置24h，中间多次混匀。5000r/min离心10min，吸取上清液，用紫外可见分光光度计（Spectrumlab752Pro）分别测定663、645和470nm处的吸光值，参照Lichtenthaler{13]的方法计算叶片单位质量叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和类胡萝卜素x（Chlx）的含量，公式如下：

1.5wp6的遗传分析

于2015年3月在海南三亚用白穗突变体wp6分别与正常穗部颜色水稻品种日本晴和9311正反交得到4个F1（wp6/日本晴，日本晴/wp6;wp6/93-11，93-11/wp6），种植F1获得F2。于2016年5月2日在安徽省农业科学院水稻研究所国家水稻育种改良分中心进行播种，6月1日移栽，单本种植。抽穗期时，观察和统计F2群体中突变表型和正常表型的植株数，计算分离比，应用孟德尔遗传规律进行遗传分析，通过x2测验，推断wp6的遗传模式。

1.6数据处理数据处理采用MicrosoftExcel2007软件和SPSS19.0统计分析软件进行统计分析。图表中数据均为3次重复的平均值。

2结果与分析

2.1wp6的表型特征及主要农艺性状

通过田间观察，野生型的叶片全生育期都为绿色，抽穗期穗部颖壳为绿色，成熟期颖壳为金黄色。突变体wp6全生育期叶片均为绿色，穗部颖壳颜色从抽穗期到成熟期一直为白色。与野生型RH003相比，wp6的生育期、株高、有效穗数、每穗总粒以及每穗实粒略高，wp6的穗长和千粒重略低，而wp6的结实率（66.85%）明显低于野生型RH003的82.40%（表1）。

2.2稻米品质比较

成熟期对突变体和野生型的稻米外观品质和蒸煮食味进行比较（表2），与野生型RH003相比，突变体wp6的长宽比、胶稠度明显低。而wp6的垩白度、透明度、碱消值以及直链淀粉含量均高于野生型RH003。野生型和突变体稻米的胶稠度和直链淀粉含量相差较大。以上结果表明，突变体的外观品质和蒸煮食味比野生型略差。

2.3叶绿素含量比较

突变体和野生型在田间种植时，对苗期（4叶期）叶片的叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和类胡萝卜素（Chlx）进行了检测（图1A），突变体和野生型叶片中的叶绿素a的含量均明显大于叶绿素b和类胡萝卜素，叶绿素a和类胡萝卜素的含量相近，而突变体叶片中的叶绿素b则低于野生型。突变体和野生型穗部抽出一半时，对穗部颖壳中的叶绿素a，叶绿素b和类胡萝卜素进行了检测（图1B），结果显示与野生型相比，突变体穗部颖壳中的叶绿素b含量略高，类胡萝卜素含量略低，而叶绿素a的含量则远低于野生型RH003。以上结果表明，突变体和野生型苗期叶片叶绿素含量差异不大，抽穗期时突变体白穗性状是由于叶绿素a含量低所致。

2.4遗传分析

突变体wp6分别与正常穗部颜色的水稻品种日本晴和9311进行正反交并种植，整个生育期，4个F1杂交种植株叶片均为绿色，抽穗期F1的穗部颜色均为绿色。抽穗期杂交组合wp6/日本晴和wp6/93-11的F2群体中正常穗部颜色植株与白穗植株分离十分明显，经x2检验均符合3∶1的分离比（表4），表明wp6的白穗性状由1对隐性核基因控制。

3结论与讨论

目前，关于水稻穗部失绿的突变体报道较少，Sanchez等{14]较早报道的白穗突变体wp1和wp2，主要特征大致相同，成熟植株穗表现为白色，植株基部3个叶片表现出白色条斑。不同的是wp1突变体的穗轴和小梗表现为绿色，wp2则表现出白色的穗轴和小梗，2个基因分别位于第7和第1染色体上。Song等{10]研究发现wlp1的表型受低温影响，在低温条件下，wlp1幼苗和穗部表现叶绿素缺陷。该基因被定位在第1染色体长臂上，编码核糖体L13蛋白质。金怡等{15]研究发现，wslwp的叶片苗期由白色转为条纹叶，随着植株的发育叶片颜色几乎恢复正常，至抽穗时颖壳颜色为白色，穗轴和小枝梗表现为绿色，穗粒成熟时变为黄色，叶绿素含量随叶色和颖壳颜色的变化发生了相应的变化，叶绿体发育表现出了明显的时间和组织特异性。该突变体被定位在第7染色体短臂上。Li等{16]鉴定了wp（t）是1个白穗突变体，少数叶片中脉呈现白色，控制该性状的基因已被定位在第1染色体上。王晓雯等{11]研究发现wp4全生育期叶色黄绿，抽穗灌浆期内外颖呈乳白色，穗轴颜色不变。颖壳中，wp4的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量均极显著下降，细胞内无明显的叶绿体结构，该基因已被定位在第8染色体上。该研究使用的穗部白化材料是优良籼型两系恢复系RH003的自然突变体，已种植多个世代，穗部白化表型等农艺性状表现稳定，突变体整株叶片呈绿色，抽穗期至成熟期穗部白色，穗轴和小梗为绿色，且性状不受温度影响。因此，推测突变体wp6是由新的位点突变引起。

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