青枯菌侵染广藿香的致病因素及寄主植物相关酶活性分析

丁奇 徐燃�┯嗨�文 杨玉秀 徐建钢

摘要[目的]探讨青枯菌不同接种体诱导后，广藿香表型的变化，并考察诱导后寄主植物体内 POD 酶活性的变化。[方法]以青枯菌不同接种体（菌体、粗毒素、菌液）进行侵染试验，观察侵染 1～7 d 后植株表型的变化。利用紫外分光光度法进行 POD 酶活性的测定。[结果]在含菌体的培养基上，大部分广藿香植株没有明显的发病症状；而菌液与粗毒素处理组，植株茎叶逐渐萎蔫。POD 酶活性测定结果表明，未经诱导的对照植株酶活性较低，7 d 内变化不大；经诱导处理的植株体内 POD 酶活性均升高，菌液组升幅最大，粗毒素组次之，菌体组升幅最小。[结论]青枯菌胞外分泌物是青枯菌致病的重要因素，诱导的广藿香体内 POD 酶活性呈动态变化，上升的幅度与接种体的致病性呈正相关。

关键词青枯菌；致病因子；广藿香；病情指数；POD

中图分类号S435.67文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）08-0138-04

Analysis of Pathogenic Factors of Ralstonia solanacearum to Pogostemon cablin and Related Enzyme Activity of Host Plant

DING Qi1， XU Ran2*，YU Shuangwen2 et al（1.College of Traditional Chinese Medicine， China Pharmaceutical University，Nanjing， Jiangsu 211198；2. School of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University，Wuhan， Hubei 430023）

Abstract[Objective] The research aimed to investigate the phenotype changes of Pogostemon cablin after induction of different inoculums of R. solanacearum， and investigate the changes of POD enzyme activity in host plants after induction.[Method]The changes of plant phenotype were observed after 1-7 days of infection with different inoculum （bacteria， crude toxin， bacteria liquid） of R. solanacearum. The enzyme activity of POD was determinated by UV-Spectrometer.[Result]In the culture medium containing the bacteria， most of the plant of P. cablin had no obvious symptoms； and bacteria liquid and crude toxin treatment group， plant stems and leaves gradually wilted.The results of POD enzyme activity showed that the enzyme activity of the control plants without induction was lower， and there was little change within 7 d.The activity of POD was increased in the inoculated plants， the increase of the bacteria liquid was the highest，the crude toxin group was the second， and the bacteria group had the smallest increase.[Conclusion]The extracellular secretion of R. solanacearum is an important pathogenic factor of R.solanacearum，and the activity of POD enzyme in the wide range of patchouli is dynamic，and the magnitude of the increase is positively correlated with the pathogenicity of the inoculum.

Key wordsRalstonia solanacearum；Pathogenic factors；Pogostemon cablin（Blanco.）Benth.； Disease index；POD

广藿香[Pogostemon cablin（Blanco）Benth.]为唇形科刺蕊草属植物，以干燥地上部分入药，具有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑的功效[1]。广藿香原产于菲律宾、马来西亚、印度等国，后引入我国，在广东省的肇庆、湛江和海南、广西等地均有栽培。广藿香生产中面临严重的青枯病危害。青枯病是一种细菌性病害，病原为青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum），简称青枯菌，可通过土壤、水传播，主要从根部进入植物的维管束，造成植物输导系统堵塞，影响水分及营养的吸收，导致植株因水分和营养匮缺而枯萎死亡[2-4]。青枯病的致病机理及植物对病原入侵的反应，是探讨有效控制病害发生和蔓延的基础。过氧化物酶（POD）能氧化酚类化合物，促进类似木质素物质的聚合作用，这种聚合物在细胞中沉积，可抑制病原菌生長与扩展[5]；还能将植物体内某些有害的代谢副产物转变为无害物质，或通过调节一些次生代谢产物的产生，以增强植物的抗性[6]。笔者以广藿香为材料，考察青枯菌不同接种体（菌体、粗毒素、菌液）诱导后植株表型的变化，同时，研究不同接种体诱导的植物体内POD酶活性的变化，探讨随着病程发展诱导的植株体内POD酶活性的动态变化，寻找青枯菌主要的致病因子，揭示青枯菌的致病机理及寄主植物的抗性生理特点，为广藿香青枯病的防治提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料。广藿香植株采自广州中医药大学药圃，由广州中医药大学药用植物学教研室潘超美教授鉴定为唇形科广藿香[Pogostemon cablin （Blanco） Benth.]。采取广藿香叶片培育试管苗，选择株高10 cm左右（带6个茎节）的试管苗作为感染材料。

1.1.2青枯菌菌株。青枯菌HX6，由广州中医药大学中药学院实验室采用组织分离法从感染了青枯病的广藿香植株中分离获得。

1.2方法

1.2.1青枯菌培养。将保存于-80 ℃的供试菌株接种于Nutrient Agar（NA）固体平板培养基，30 ℃培养48 h，将活化的菌株转到加有150 mL液体 NA 培养基的 250 mL锥形瓶中，在 30 ℃、200 r/min摇床培养 12 h。

1.2.2含不同青枯菌接种体的Murashge and Tucker（MT）培养基的制备。取已培养的含青枯菌的NA液体培养基，于30 ℃、200 r/min恒温振荡培养12 h后，测量细菌培养液的吸光度A，并将其于4 000 r/min离心30 min，取上清液，过0.22 μm的微孔滤膜，即得粗毒素原液[7]，沉淀即为菌体。将青枯菌菌液、菌体、粗毒素加入MT培养基中，分别使其终浓度为2.0×108 cfu/mL。

1.2.3青枯菌不同接种体对广藿香的致病性试验。将广藿香试管苗伤根处理后接入添加了菌体、菌液、粗毒素的MT培养基中，进行致病性试验，以未添加的MT培养基中培养的广藿香试管苗为空白对照，于诱导后7 d内进行发病调查。

植株病情分级标准：0级为健康；1级为1～2叶片萎蔫的植株；2级为3～5叶片萎蔫的植株；3级为大部分叶片萎蔫的植株；4级为整株萎蔫或即将枯死的植株。病情指数计算按公式：病情指数=100×∑各级发病植株数×相应级数/（调查总植株数×最高级数）进行计算[8]。

1.2.4酶液提取。分别称取经青枯菌诱导1～7 d 的广藿香植株及未经诱导的对照植株叶片0.5 g，加入1.0 mL的0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液 （pH 7.4），冰浴研磨。在4 ℃下，10 000 r/min 离心10 min，取上清液即为酶液，置于-80 ℃冰箱中保存[9]。

1.2.5POD酶活性测定。取酶液100 μL，用愈创木酚和 H2O2 比色法测定，加入3 mL的0.1 mol/L 磷酸缓冲液 （pH 6.5），其中每50 mL缓冲液含有愈创木酚 28 μL、30%过氧化氢19 μL，测吸光密度值△OD470（U/g）[9]。

1.3数据统计“1.2.3”、“1.2.5”试验中，每处理设3次重复，试验数据均以均差±标准差表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，多处理的多重比较采用LSD方法测验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1青枯菌不同接种体对广藿香的致病效应取浓度为2.0×108 cfu/mL的青枯菌 HX6 菌液进行离心、过滤，获得菌体和粗毒素，分别将菌体、粗毒素、菌液添加到 MT 培养基中，分别接种广藿香试管苗进行侵染试验，观察植株表型的变化，结果见图1。从图1可以看出，对照植株葉片舒展、色泽鲜绿，茎秆直立。菌体诱导的处理，大部分植株始终生长良好，在诱导后期仅少量植株表现轻微的发病症状。粗毒素诱导的处理，第1天时，植株长势良好；第 3天时，植株下部叶片出现稍微卷缩、泛黄现象；第 5天时，植株下部叶片失水严重，叶片萎垂，叶色发黄，茎秆有所弯曲；第 7天时，植株下部叶子枯黄，叶子下垂脱离严重，茎秆出现褐化，部分植株死亡。菌液诱导的处理，植株的表现与粗毒素处理相似。

从青枯菌侵染的植株 1～7 d 内的发病病情（表1和图1）可以看出，不同接种体对广藿香的致病性有所不同。其中，菌液和粗毒素致病性较强，侵染 4 d 时，植株病情指数即达 60 左右，到第7天病情指数匀达到 100，而菌体接种的植株，到侵染第7天，病情指数低于30。

综上所述，菌体处理，广藿香植株发病情况不明显；而粗毒素及菌液的处理，植株表现渐进的发病过程，发病较为严重，且2种接种体的致病效应较为一致。说明青枯菌胞外分泌的粗毒素是造成植株发病死亡的重要原因。

2.2不同青枯菌接种体诱导的广藿香POD活性变化分别配制含不同接种体（菌液、粗毒素、菌体）的培养基，对广藿香进行诱导试验，以未经诱导的植株为对照。在侵染的 1～7 d 时间内每天取诱导植株及对照植株提取酶液，测定POD酶活性，结果如图 2。由图 2 可见，对照组植株POD 酶活性较低，且在7 d内变化不大，酶活性值均值为3.26 U/g。青枯菌诱导处理后比对照的 POD 酶活性升高明显，其中以菌液诱导组升高变化最为显著，菌液诱导的第1天POD酶活性就开始明显的上升，第3天达到峰值（10.08 U/g），随后转为下降趋势，第 6天与对照酶活性水平持平，第 7天低于对照组。粗毒素诱导的广藿香组 1～2 d 与对照组比较未见明显差别，在第 3天有所上升，第 4天酶活性达到峰值（7.25 U/g），第 5天开始下降，第 6天有小幅回升之后，第 7天下降至与对照组接近。菌体诱导的广藿香酶活性变化较前 2 组相比更为平缓，总体呈现先缓慢上升，第 4天达到极值（4.68 U/g），再小幅下降，并一直平稳维持稍高于对照组到第 7天。比较 3 组诱导组的酶活曲线发现，菌液组的酶活性变化幅度最大，呈现先显著上升，后逐步下降至明显低于对照组；粗毒素组的酶活性增长较为缓慢，在第 4天时到达峰值，然后急剧下降；菌体组的酶活性上限值低于前2个处理，在第 4天达到峰值后呈稳定的递减趋势。其中，粗毒素和菌液诱导处理的植株酶活性均在第 6天或第 7天时低于对照组。

3讨论与小结

有关青枯菌致病的机理，有研究报道，采用胞外多糖（EPS）缺陷型突变菌系与正常产生EPS的野生型菌系对野油菜黄单胞菌致病性比较发现，即使将大量细菌注射入植物茎干，前者极少引起植物的萎蔫和死亡[10]。王军等[11]研究桉树青枯菌菌株致病性分化与其菌量增殖及胞外多糖产量的联系发现，强致病性菌株EPS的总产量及单个细胞EPS产量均高于弱致病性菌株，表明青枯菌的致病力与胞外多糖有关系。该研究结果表明，广藿香被青枯菌不同接种体诱导后，在表型变化上，菌体对广藿香的致病力很弱，而含有胞外分泌物的粗毒素和菌液感染广藿香后，植株发病严重，第7天后，大多数植株萎蔫或死亡，表明青枯菌胞外分泌物是重要的致病因子。

植物在生物逆境中不断受到病原微生物侵袭，在长期的相互作用、相互选择、相互适应乃至协同进化的过程中，逐渐获得了一系列复杂的防御机制来保护自己，使得植物的抗病性与病原物致病性之间达到动态的平衡，以此来减轻病害的危害程度。近些年来，植病学者已经开始注意到植物抗病的本质问题，认识到植物的保护反应是复杂的新陈代谢过程，对病原物侵入及扩展的生理反应是以酶的催化活动而实现的。植物经诱导物诱导处理后体内的防御酶系活性会提高[12]，它们是植物抵抗病原菌侵染的最有效机制之一[13-14]。利用植物的诱导抗病性，以提高抵抗病害的能力，是植物病害防治的一种新思路。已有大量研究表明，POD是植物次生代谢过程的关键酶之一，与植物的抗性紧密相关；POD不但具有抑制病原物水解酶的作用，而且还能抑制病原物的生长和繁殖，是植物的重要保护酶之一[15]。

安徽农业科学2017年

该研究探讨了不同青枯菌接种体（菌液、粗毒素、菌体）诱导的广藿香POD酶活性的变化，结果表明，未经诱导的对照植株的POD防御酶活性处于较低的水平且比较平稳；不同青枯菌接种体诱导处理的植株7 d 内POD酶活性明显高于对照，菌液、粗毒素诱导组POD酶活性峰值均显著高于菌体诱导组。在不同致病体致病性试验中，通过对植物病程表型的观察，证明菌液、粗毒素的致病性高于菌体，说明青枯菌的致病性越强、广藿香植株相关酶活性越高，表现为菌液、粗毒素诱导组广藿香植株的POD酶活性增加的速度快，而且达到峰值也更高。如何利用广藿香本身的防卫体系，借助于诱导因子激发植物整體抗性水平，以提高抵抗病害的能力，是需要进一步研究的问题。

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