帝玉露的离体培养及快速繁殖技术研究

何佳越 刘天乐 余丽萍 唐玲 黄雪丽

摘要[目的]建立帝玉露的叶片离体快繁体系，为帝玉露商业化快速生产、种质资源的保存及新品种的选育提供技术支持。[方法]以多肉植物帝玉露不同成熟度叶片为外植体进行诱导、增殖和生根培养，探究不同激素和NaH2PO4浓度对其愈伤组织诱导、分化及生根移栽的影响。[结果]帝玉露愈伤诱导最佳培养基为MS+2.00 mg/L 6-BA+ 0.20 mg/L NAA，诱导率达95.00%；愈伤组织最佳分化培养基为MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+40.00 mg/L NaH2PO4 ，分化时间短且分化率最高为 96.70%；最佳壮苗生根培养基为1/2MS+0.20 mg/L NAA，移栽成活率为96.00%。[结论]使用成熟叶片作为外植体可以建立帝玉露的快繁体系。

关键词帝玉露；叶片；组织培养；愈伤组织诱导；快速繁殖

中图分类号S604+.3文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）08-0148-03

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation Techniques of Haworthia cooperi var.dielsiana

HE Jiayue1，LIU Tianle2，YU Liping1，HUANG Xueli1* et al（1.College of Agriculture，Sichuan Agricultural University，Chengdu，Sichuan 611130；2.Development School Chengdu No.7 High School，Chengdu，Sichuan 611130；3.College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu，Sichuan 611130）

Abstract[Objective] Tissue culture and rapid propagation techniques of Haworthia cooperi var.dielsiana were established to provide technical support for commercial rapid production and conservation of the germplasm resources and breeding new varieties.[Method] The effect of different plant growth regulating substances and concentration of NaH2PO4 on callus induction， bud induction， rooting and transplanting were researched by induction， proliferation and rooting culture，by using different maturity leaves of H.cooperi var.ielsiana as explants.[Result] The best callus induction medium was MS +2.00 mg/L 6-BA+ 0.20 mg/L NAA， the callus induction rate was 95.00%； the best bud induction medium was MS+ 1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+40.00 mg/L NaH2PO4，which the bud induction time was short and the bud induction rate reached 96.70%； the best rooting medium was 1/2MS + 0.20 mg/L NAA， the transplanting survival rate was 96.00%.[Conclusion]We should use mature leaves as explants to establish the rapid propagation system of H.cooperi var.dielsiana.

Key wordsHaworthia cooperi var.dielsiana；Leaves；Tissue culture；Callus induction；Rapid propagation

帝玉露（Haworthia cooperi var.dielsiana）為独尾草科十二卷属植物，植株整体呈莲座状，叶片肉质肥厚且顶部有透明的“窗”，“窗”大而透亮，有顶毛，原产于南非，具有较高的观赏价值。目前市面上的各玉露品种大多采用侧芽、叶插或砍头繁殖，但此类方法繁殖系数低、繁殖周期长且受限于部分品种单生不易萌发侧芽，难以满足市场需求；也有采用玉露种子播种繁殖，但

投入的时间成本和劳动力成本都有所增加，且长出的实生苗通常发生性状改变，同一批苗的生长速度及外观都有差异，因而不适合投放市场。为满足市场对十二卷属植物的需求，有学者对该属植物进行了组培快繁的研究[1-8]。在十二卷同属植物组培快繁体系中，花茎、子房是最主要的外植体。而在十二卷属植物组培快繁体系中使用幼嫩花茎或子房作为外植体存在较大的局限性，母本植物抽茎开花具有季节性且需要生长到一定年限才能开花，使用其多浆叶片作为外植体鲜有报道。

使用叶片作为外植体建立帝玉露的组培快繁体系，可能因叶片肉质化水分含量高导致灭菌困难及灭菌后成活率低。

目前对多肉植物玉露的研究涉及品种较少，帝玉露是十二卷属植物中的经典品种，关于其组培快繁的相关报道较少。研究帝玉露叶片作为外植体的组培快繁，对其商业化快速生产、种质资源的保存及新品种选育有重要意义。该研究以帝玉露叶片作为外植体，探究叶片成熟度对其产生愈伤的影响和不同激素组合对其诱导培养的影响，建立帝玉露组培快繁体系，为工厂化快速繁殖及种质资源的保存提供技术支持。

1材料与方法

1.1供试材料帝玉露不同成熟度叶片：成熟的叶片、幼嫩的新生叶片。

1.2试验方法

1.2.1无菌材料的获得。将帝玉露不同叶片从植株小心剥离，流水冲洗2～3 h；在无菌瓶中用75%酒精浸洗10 s，无菌水清洗4次；用0.1%升汞浸洗8 min，无菌水清洗4次，切取0.5 cm×0.5 cm的叶片接种于愈伤诱导培养基中。

1.2.2培养基不同激素浓度配比的筛选。

1.2.2.1愈伤组织诱导。以MS为基本培养基，添加不同浓度激素配比，设置4种诱导培养基：①MS + 3.00 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA；②MS + 3.00 mg/L 6-BA + 0.20 mg/L NAA；③MS + 2.00 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA；④MS + 2.00 mg/L 6-BA + 0.20 mg/L NAA。将灭菌好的叶片接种至4种培养基中，每处理接种10瓶，每瓶4个外植体，30 d后统计愈伤组织诱导率。

1.2.2.2愈伤组织分化。以MS为基本培养基，添加不同浓度激素配比和NaH2PO4，采用L9（33）正交表安排试验（表1），将愈伤组织接种于培养基中，观察愈伤组织分化情况，45 d后统计愈伤组织的分化率。

1.2.2.3生根培养。将分化出的新芽分单株接种至以1/2MS为基本培养基并添加不同浓度激素配比的4种培养基中：①1/2MS+ 0.05 mg/L NAA；②1/2MS+ 0.20 mg/L NAA ；③1/2MS+0.05 mg/L IBA；④1/2MS+ 0.20 mg/L IBA。观察根系生长情况，30 d后统计生根率。

1.2.3驯化移栽。将已经生根壮苗的试管苗进行驯化移栽。移栽前将培养瓶置于室外炼苗4 d后，取出植株，洗净培养基后晾干待植。基质为泥炭、蛭石和珍珠岩按3∶1∶1混合，用百菌清800倍液消毒，将晾干后组培苗栽植至种植盘内，成活前避免过量浇水导致烂根。日常管理中浇水见干见湿、可少量施用缓释肥，栽培环境避免阳光直射和过于荫蔽。30 d后统计成活率，成活率=成活且生长正常的苗数/移栽的苗数×100%。

1.3培养条件

培养基pH 5.8，培养温度（25±2） ℃，愈伤组织诱导前期黑暗培养10 d，其余阶段光照强度2 000 lx，光照时间12 h/d。

1.4观测指标及数据处理

愈伤组织诱导阶段，观测其诱导率及愈伤生长情况；愈伤组织分化阶段统计分化出芽时间、分化率及芽生長情况；不定根诱导阶段，观测生根情况及生根率。试验数据采用DPS数据处理系统进行统计分析，同一列数值后不同小写和大写字母分别表示差异达0.05和0.01显著水平。

2结果与分析

2.1叶片成熟度与发生愈伤组织的关系

经过重复愈伤试验，在相同激素配比的培养基中，不同成熟度的帝玉露叶片愈伤发生时间有所不同，最先出愈的是幼嫩新叶，较最晚出愈的成熟老叶提前15 d左右，但愈伤少，成熟老叶产生的愈伤较多，但其污染率较新叶稍高。

2.2愈伤组织诱导

由表2可知，培养30 d后，培养基①和②中的愈伤组织生长量较大，但质地较疏松，呈黄白色或淡黄色，并产生一定程度玻璃化现象，在后续培养过程中逐渐褐化。培养基③和④均能诱导质地较佳的愈伤组织，但培养基④中的诱导率较培养基③诱导率高29.00%以上。培养基④中愈伤质地较致密，呈黄绿色（图1），外植体继续培养后，所有愈伤组织生长速度快，质地较致密，颜色浓绿。由此可见，不同激素浓度配比对帝玉露诱导率的影响有显著差异，对愈伤品质的影响较为明显，培养基④为愈伤诱导最佳培养基。

2.3愈伤组织分化

将前期诱导的愈伤组织黄绿色部分在无菌条件下切成0.5 cm×0.5 cm的愈伤块，分别转接至9种不同的分化培养基（表1）中继续培养，30 d后愈伤组织继续生长且逐步开始分化出芽，芽生长情况见表3。结果表明，1、2、3、5、8、9号培养基中的愈伤组织在30～40 d内不同程度地在芽点部位形成丛生芽，4、6、7号培养基中始终未见芽的形成。1、2号培养基中的愈伤组织生长情况较佳，分化出的芽数量较多，5号和9号培养基中的效果相近。综合分析可知，不同浓度激素和NaH2PO4配比处理间对愈伤分化的影响差异显著，1（图2）、2号培养基中的愈伤分化情况较佳，但从分化时间来看，1号培养基中分化出芽时间较短，可见1号培养基为愈伤组织最佳分化培养基。

2.4生根培养及驯化移栽

待分化出的芽长到3～4片叶时，用镊子将芽从愈伤组织掰下并插入生根培养基，没入培养基深度约为植株1/3。培养30 d后，大部分植株产生数量、长度、粗细不等的根系。不同处理生根率、平均根数、平均根长及根的生长情况均有所不同（表4），NAA和IBA对帝玉露生根影响差异不显著，但不同浓度激素处理差异显著。0.05 mg/L NAA和IBA能诱导根的形成，生根率分别为77.50%和72.50%，根生长状态较差；0.20 mg/L NAA和IBA处理，生根率均在90.00%以上。但从平均根数及根的生长情况来看，0.20 mg/L NAA效果最佳，平均根数达4.8条，根较长且粗壮（图 3）。经过生根壮苗的组培苗进行驯化移栽效果较好（图 4），成活率为96.00%。

3讨论与结论

不同成熟度的帝玉露叶片对其发生愈伤有一定关系。成熟叶片的有机物质积累较多，产生愈伤多、品质较好，但生长处于停滞阶段，生命活动较缓慢，所以发生愈伤的时间较晚。由于成熟叶片位置更低，直接接触土壤或基质，使其灭菌较为困难，故更容易发生污染。新生幼嫩叶片的营养物质积累较少，产生愈伤量相对较少，生长旺盛，则其发生愈伤的时间更早。幼嫩叶片所处位置被外围叶片包裹，与外界环境相对隔离，所以更容易得到无菌材料。但取用新生叶片对于母本植株影响较大，且其发生的愈伤品质不及成熟叶片，综合考虑使用植株底部的成熟叶片作为外植体更合适。激素是植物外植体愈伤组织诱导及分化的关键因子之一，不同的激素配比，其愈伤诱导及分化差异显著[9-10]。帝玉露愈伤组织的最佳诱导培养基为MS + 2.00 mg/L 6-BA +0.20 mg/L NAA，与朱天华等的研究一致[11]，愈伤组织在低浓度的6-BA和NAA配比中增殖和分化情况较好，产生大量优质愈伤组织，并配合较高浓度NaH2PO4有利于分化出芽，且芽的长势较好，与张燕珍[12]对卷荚相思的研究结果一致。试验中较高浓度的6-BA、NAA和不同浓度的NaH2PO4处理大多也能诱导出芽，只是诱导率及芽的状态之间存在差异。在生根培养中使用1/2MS培养基取得了较好效果， 印证了大多数植物的生根能力在大量元素和微量元素浓度降低至1/2的培养基中更高这一结论 [13]。有报道多肉植物使用叶片作为外植体会因叶片水分多，灭菌后存活困难[14]。该研究表明，帝玉露的肉质多浆叶片作为外植体进行灭菌后并不受影响，幼嫩及成熟的叶片均能诱导出愈伤组织。以帝玉露叶片作为外植体建立组培快繁体系可避免使用花茎或子房作为外植体的时限性，可进行周年培育获得大量组培苗，突破自然条件的繁育限制，为高效优质生产帝玉露组培苗、保存种质资源、快速繁育及研究其同属新品种提供技术支持。

参考文献

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