鸡胸软骨胶原的提取及其结构表征

张艳艳 刘海英

摘要 [目的]提取鸡胸软骨中的胶原，并对其进行检测。[方法]以鸡胸软骨为原料，采用酶法提取其中的胶原，并进行紫外光谱检测、傅里叶变换红外光谱检测、SDS-PAGE、氨基酸分析、圆二色谱检测及肽指纹图谱检测。[结果]胶原的提取率是0.11%（以湿重计），紫外最大吸收波长为217 nm；SDS-PAGE显示，胶原含有一条较粗的α带和一条较细的β带；氨基酸分析显示，羟脯氨酸为99残基/1 000氨基酸残基。[结论]该方法提取得到的胶原是典型的Ⅱ型胶原，且很好地保持了其天然结构，具有较高的纯度。

关键词 胶原；鸡胸软骨；Ⅱ 型胶原；提取；结构表征

中图分类号 S879；TS251.92文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）15-0155-03

Abstract [Objective]The research aimed to extract collagen from chicken sternal cartilage and detected it.[Methods]Using chicken sternal cartilage as raw material，the collagen was extracted by enzymatic method and detected by ultraviolet spectroscopy，Fourier transform infrared spectroscopy，SDS-PAGE，amino acid analysis，circular dichroism detection and peptide fingerprint detection.[Result]The extraction rate of collagen is 0.11%，based on the wet weight of chicken sternal cartilage.Ultraviolet spectral analysis showed that the characteristic absorption wavelength of collagen was 217 nm.Analysis results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide-gel electrophoresis（SDS-PAGE） showed that there was a heavy α-chain and a light β-chain.Amino acid components showed that hydroxyproline was 99 imino acid residues/1 000 residues.[Conclusion]The collagen extracted by this method is a typical type Ⅱ collagen，and its natural structure is well maintained with high purity and the product has a high purity.

Key words Collagen；Chicken sternal cartilage；Type Ⅱ collagen；Extraction；Structural characterization

膠原是一类具有独特结构的蛋白质，广泛存在于动物组织中，是哺乳动物细胞中最丰富的蛋白质，约占整个细胞总蛋白的1/4[1]。Ⅱ 型胶原主要存在于动物的白色结缔组织中[2]，由3条相同的α1（Ⅱ）链以超螺旋的方式构成软骨的基本结构，具有维持关节软骨的形态结构和抗张力强度的功能[3]。Ⅱ 型胶原特有的结构和化学组成使其在生物医学材料、化妆品及食品等领域得到了广泛应用。近年来研究表明，Ⅱ 型胶原还可以作为药物和保健品来防治类风湿性关节炎（RA）。

我国禽肉加工产量较高，每年在禽类加工过程中都会产生大量的鸡胸软骨等副产品。以往鸡胸软骨大多被当作废弃物直接丢弃或用作饲料生产，造成了环境污染和大量的资源浪费。Ⅱ型胶原是鸡胸软骨中的主要成分。笔者以鸡胸软骨为原料，采用酶法提取Ⅱ型胶原并对其结构和性质进行研究，旨在为充分利用鸡骨资源、减少环境污染、解决禽类加工资源综合利用等问题，并获得一种具有高附加值的生物活性物质提供依据，具有重要的理论意义和实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡胸软骨，市场购买；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，北京博特森生物技术有限公司；标准蛋白（分子量6.5～270.0 kDa），上海碧云天生物技术有限公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X），上海碧云天生物技术有限公司；胃蛋白酶（1 200 U/g），国药化学试剂有限公司；透析袋（8 000～140 000 Da）；考马斯亮蓝G250、甲醇、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、乙酸、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）等，均为分析纯。

1.2 主要仪器

Agilent1100氨基酸分析仪，美国安捷伦公司；UV-1800紫外可见分光光度计，日本岛津公司；IS10傅立叶红外光谱仪，美国Nicolet公司；1658001 Bio-Rad伯乐Mini-PROTEAN Tetra小型垂直电泳槽，美国Bio-Rad公司；UltrafleXtreme基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱仪，布鲁克·道尔顿公司；MOS-450圆二色光谱仪，法国Biologic公司；77530-30LABCONCO6L冻干机，照生有限公司；5424 Eppendorf台式高速离心机，德国Eppendorf艾本德股份有限公司；电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 胶原提取工艺流程。鸡胸软骨→清洗→去骨膜→切碎→脱脂→冻干→浸提→盐析→透析→冻干→成品。

1.3.2 胶原提取步骤。

1.3.2.1 鸡胸软骨的预处理。

将冷冻的鸡胸软骨，用蒸馏水清洗干净，去除骨膜，切成约2 mm×2 mm×2 mm的小块，混悬于10%正乙烷中，搅拌，每8 h更换1次，连续浸泡24 h去脂。蒸馏水冲洗数次后，预冻，真空冷冻干燥48 h，-20 ℃保存备用。

1.3.2.2 胶原的提取。所有操作均在4 ℃条件下进行。将冻干的鸡胸软骨，浸泡于含有1%（W/V）胃蛋白酶、料液比为1∶20的0.5 mol/L HAc溶液24 h[4]，用滴管逐滴加入溶解完全的NaCl溶液[5]，使NaCl最终浓度为0.9 mol/L，盐析出絮状物，4 000 r/min，10 min，弃去上清液体，沉淀即为粗制Ⅱ型胶原。将沉淀溶解于0.5 mol/L HAc溶液中，如此重复盐析、沉淀、离心纯化3次，使用分子截留量为8 000～14 000 Da的透析袋，用0.5 mol/L HAC透析72 h后，预冻，真空冷冻干燥后即为纯化后的Ⅱ型胶原。将冻干的样品保存在-20 ℃下备用。

1.3.2.3 提取率计算。胶原提取率=冻干所得的胶原质量/鸡胸软骨質量×100%。

1.3.3 胶原的检测与结构表征。

1.3.3.1 紫外光谱（UV）检测法。

将样品溶于0.05 mol/L HAc溶液中，配制成浓度为0.3 mg/mL的胶原溶液。以0.05 mol/L的HAc溶液作为空白，在190～400 nm波长下进行紫外光谱检测。

1.3.3.2 傅里叶变换红外光谱（FTIR）检测法。

将样品与KBr固体（1∶100）混匀，研磨，压片，使用傅里叶变换红外光谱仪，于4 000～400 cm-1进行扫描，分辨率为4 cm-1，扫描频率为16次。

1.3.3.3 SDS-PAGE凝胶电泳。

按照Laemmli[6]将样品溶于适量上样缓冲液，配制成10 mg/mL的胶原溶液，煮沸3 min，自然冷却，4 000 r/min离心10 min。采用标准蛋白标记，分离胶和浓缩胶分别为6%和5%，上样量为4 μL。先于80 V电压下电泳30 min，后于120 V下电泳100 min。电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝R-250染色30 min，脱色液脱色3～4次，每次30～40 min。

1.3.3.4 肽指纹图谱。

按照“1.3.3.3”所述制备电泳凝胶。电泳结果表明，鸡胸软骨中胶原主要由一条较粗的α带和一条较细的β带构成。为了进一步证实胶原为 Ⅱ 型胶原，切除 α亚基，经脱色、酶解、萃取、点样后，通过质谱测定出各片段的准确质量，然后将获得的数据在蛋白质数据库中进行搜寻、鉴定[7]。

1.3.3.5 氨基酸分析。

称取100 mg样品，溶于8 mL的6 mol/L HCl中，充氮气3 min，溶液呈微沸状态，密封，120 ℃烘箱中水解22 h，加4.8 mL 10 mol/L NaOH中和，定容，双层滤纸过滤，15 000 r/min，离心10 min，取上清液于氨基酸自动分析仪分析。

1.3.3.6 圆二色谱。

将样品溶于0.05 mol/L HAc溶液，配成浓度为0.3 mg/mL胶原溶液，在190～250 nm波长下平均扫描3次；并在218 nm处对胶原溶液进行温度扫描，温度为19～50 ℃，获得胶原溶液的变性曲线，变性温度即为变化率一半时所对应的温度。

2 结果与分析

2.1 鸡胸软骨胶原的提取率 经计算，鸡胸软骨胶原的提取率为0.11%（以湿重计）。

2.2 胶原的检测与结构表征

2.2.1 UV检测法。

鸡胸软骨的紫外吸收光谱如图1所示。胶原的肽链中含有C=O、COOH、CONH2等生色基团，可以在近紫外区检测到吸收峰。从图1可以看出，在217 nm处有一个最大吸收峰，与 Ⅱ 型胶原的紫外特征吸收峰较吻合。

2.2.2 FTIR检测法。

图2是鸡胸软骨中所提取的Ⅱ型胶原的傅里叶红外光谱图。由图2可知，Ⅱ 型胶原的红外图谱有4个特征吸收峰，分别为3 370、2 930、1 640和1 540 cm-1，分别命名为酰胺 A带、酰胺 B 带、酰胺 I 带和酰胺 Ⅱ 带。一般情况下，酰胺A带和酰胺B 带主要是N-H 的伸缩振动，酰胺I带是C=O的伸缩振动和N-H 的弯曲振动，酰胺 Ⅱ 带是 N-H 的弯曲振动和 C-N 的伸缩振动。将该红外吸收图谱与文献[8]中报道的天然Ⅱ型胶原的图谱对照，该图中的波数和吸收峰位置与其基本一致，说明该研究中的提取工艺没有破坏 Ⅱ 型胶原的天然结构。

2.2.3 SDS-PAGE凝胶电泳法。

根据鸡胸软骨胶原的电泳结果（图3），该试验提取的胶原样品的谱带显示，与曹慧等[4]的电泳图谱结果一致。图中，样品出现2个条带，由于Ⅱ型胶原主要由3条相同的α1（Ⅱ）链构成，所以电泳图谱中出现一条含量较高的α带和少量的β二聚体，二者的分子量分别位于130和250 kDa的位置。

2.2.4 肽指纹图谱。鸡胸软骨胶原的肽指纹质谱结果显示，鉴定了胶原的α条带，获得注册号为gi31340542，分子量/PI为120043/7.22，得到1%的重叠范围，总评分为63分，一共有1个肽段相匹配。通过MALDI—TOF/TOF质谱法分析了鸡胸软骨胶原的α条带，结果中的分数> 61表示同一性或广泛同源性（P<0.05），结果可信。

2.2.5 氨基酸分析。

从鸡胸软骨胶原氨基酸组成（表1）可以看出，主要氨基酸是甘氨酸（250残基/1 000氨基酸残基），其次为谷氨酸（128残基/1 000氨基酸残基）、丙氨酸（101残基/1 000氨基酸残基）、羟脯氨酸（99残基/1 000氨基酸残基），符合Ⅱ型胶原的特征[9]。

2.2.6 圆二色谱。

圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种快速、简单的方法[10]。蛋白质中氨基酸的α-碳原子是不对称的，具有光学活性；蛋白质的肽链走向也是不对称的，也具有光学活性。当平面偏振光通过这些光活性的生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左右圆偏振光的吸收不相同，产生了吸收差值，由于这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色性。一般蛋白质的圆二色光谱分成两段，波长在185～245 nm 称为远紫外区，245～320 nm 称为近紫外区。远紫外区是蛋白质肽链的吸收峰，反映了主链的构象。

鸡胸软骨中提取的胶原在远紫外区的圆二色谱如图4所示，197 nm处存在一个负峰，223 nm处存在一个正峰，说明胶原三股螺旋保持较好，符合胶原三股螺旋典型特征的圆二色谱峰型。

物质在温度变化过程中，往往伴随着微观结构、宏观的物理和化学性质等变化。胶原的热变性温度（Ts）是反映其天然螺旋结构的重要指标之一。当体系的温度达到Ts时，胶原分子从伸展的纤维态转变为无规卷曲状，即胶原变性为明胶。图5是鸡胸软骨胶原的变性曲线，由图可见，变性温度为39 ℃。

3 结论

Ⅱ型胶原分子间通过交联键相连使各分子间相互聚合成大分子稳定结构，所以，Ⅱ型胶原是一种难溶性蛋白。这种特性阻碍了胶原的提取。鉴于以上情况，试验选用酸溶液-胃蛋白酶体系，使之成为可溶性并保持胶原分子的完整性。该试验采用酶法对鸡胸软骨胶原进行提取，并对其进行UV、FTIR、SDS-PAGE和CD等检测，证明所提胶原为Ⅱ 型胶原。我国是养鸡大国，鸡胸软骨产量较大，但作为禽产品加工的主要副产物并没有得到充分的开发和利用，因此开发利用鸡胸软骨资源用以生产Ⅱ型胶原，提高其附加值，具有极大的经济意义。

参考文献

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