响应面法优化仙人掌酵素的发酵工艺

时间：2024-05-22

张良刘媛洁包珍肖勇生

摘要 [目的]利用酵母菌和乳杆菌发酵仙人掌制备仙人掌酵素。[方法]首先以糖的添加量、菌种比例、接种量、发酵温度、发酵时间为因素进行单因素试验，确定超氧化物歧化酶（SOD）活性较大时各因素相应的范围；然后分析试验条件，应用Box-Behnken中心组合设计，以糖的添加量、接种量和发酵温度为因素，以SOD活力的变化为响应值进行试验，运用SAS统计软件对试验数据进行分析，建立二次响应面回归模型，得出重要因素的最佳水平，从而确定最佳的发酵条件。[结果]经响应面法优化获得仙人掌酵素发酵工艺的参数如下：糖的添加量55.0%、接种量4.0%、发酵温度34.0 ℃，在优化条件下，SOD活力达到323.21 U/g。 [结论]该研究可为仙人掌酵素的生产提供科学依据。

关键词仙人掌；酵素；发酵；响应面法

中图分类号 TS201.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）17-0170-03

Abstract [Objective]To prepare cactus enzyme by fermentation of cactus with yeast and lactobacillus. [Method]The influence of additive amount of sugar，proportion of species，inoculation amount，fermentation temperature and fermentation time on SOD enzyme activity producing by cactus fermentation were studied through single factor experiment，and approximately determined the amount of the various factors.Then the additive amount of sugar，the inoculation amount and the fermentation temperature were chosed as three factors，the center combination of BoxBehnken design experiments was used to study the change of SOD enzyme activity in the fermentation as response value.The experiment data were analyzed by the SAS statistical software to set up quadratic response surface regression model for obtaining the optimal level of the important factor， determining the optimum conditions of fermentation. [Result]The response surface method results showed the optimum condition of producing SOD enzyme activity by cactus fermentation was as follow： the additive amount of sugar 55.0%，the inoculation amount 4.0% and the fermentation temperature 34.0 ℃，in the optima conditions，the SOD enzyme activity was 323.21 U/g. [Conclusion]The study can provide scientific basis for the production of cactus enzyme.

Key words Cactus；Enzyme；Fermentation；Response surface methodology

仙人掌（Opuntia spp.）为仙人掌科（Cactaceae）仙人掌属（Opuntia）双子叶植物，含有丰富的微量元素、蛋白质、维生素、多糖类、黄酮类、果胶及18种氨基酸[1-2]。仙人掌具有降血糖、降血脂、降血压及预防心脑血管疾病等功效[3-4]。酵素（enzyme）又称作酶，是生物体产生的一种具有催化作用的大分子物質[5]。它是以一种或多种果蔬等为原料，经多种有益菌发酵制备而成的，富含多种生物酶、矿物质、维生素、有机酸、多酚类等功能性生物发酵产品[6]，具有抗氧化、抗菌消炎、润肠通便、增强机体免疫力、改善消化吸收等保健功能[7-8]。笔者以仙人掌为原料，利用酵母菌和乳杆菌发酵制备仙人掌酵素，探索制备的工艺条件，为仙人掌的综合利用及工业生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与主要试剂。仙人掌，市售米邦塔仙人掌；酵母菌，安琪酵母股份有限公司；乳酸菌，江西省食品发酵研究所微生物菌种保藏中心。

1.1.2 主要仪器。P270普通摇床，中国科学院武汉科学仪器厂；移液枪，上海荣泰生物工程有限公司；Sw-CJ-1Bu型单人净化工作台，苏州净化设备有限公司；台式电热恒温培养箱，湖北省黄石市医疗器械厂；全自动灭菌锅，上海三申医疗器材厂；3K18冷冻离心机，美国Sigma公司；恒温水浴锅，江苏金坛市瑞华仪器有限公司；pH计（S23C）型酸度计，上海雷磁仪器厂；分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 工艺流程

仙人掌→清洗→臭氧处理→淋干→切块→糖和原料按比例混合→装罐→添加复合菌种→密封恒温发酵90 d→后熟处理→过滤→仙人掌酵素原液。

1.3 操作要点

1.3.1 预处理。清洗仙人掌的表面固型杂质，去除仙人掌上的毛刺，用臭氧发生器处理后沥干，将仙人掌切成4 cm3的小块备用。

1.3.2 酵母菌的活化和培养。将酵母菌菌粉用蒸馏水混匀，30 ℃水浴活化1 h后，无菌条件下取适量菌液均匀涂布于YPD固体培养基上，30 ℃恒温培养48 h。继续重复上述步骤，继代培养2次后，菌种才可用于发酵使用。

1.3.3 乳杆菌的活化和培养。将乳杆菌菌粉用蒸馏水混匀，37 ℃水浴活化1 h后，无菌条件下取适量菌液均匀涂布于MRS固体培养基上，37 ℃恒温培养24 h。继续重复上述步骤，继代培养2次后，菌种才可用于发酵使用。

1.3.4 接种和发酵。将处理好的仙人掌块按照一层红糖一层仙人掌块的方式逐层放入到发酵罐中，糖的添加量为50%，调节初始pH为6.5，将酵母菌和乳杆菌以2∶3的体积比进行混合后制备成混合菌种（酵母菌活菌数为1×106 CFU/mL，乳杆菌活菌数为1×107 CFU/mL），并按照4%的接种量加入到发酵罐中，在34 ℃恒温密闭发酵90 d，当发酵液不再产生气泡时，发酵结束。

1.3.5 后熟与过滤。发酵罐在5 ℃条件下恒温密闭保藏30 d，使发酵液中各成分充分反应。后熟后将发酵液在150 r/min离心10 min的条件下过滤分离，所得液体为仙人掌酵素原液。

1.4 试验设计

1.4.1 单因素试验。分别以糖的添加量、菌种比例、接种量、发酵温度、发酵时间为响应因素，研究不同水平下各因素对仙人掌酵素超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响。

1.4.2 Box-Behnken 试验设计。在单因素试验的基础上，利用 Box-Behnken 试验设计原理，采用3因素3水平的响应面分析法，以糖的添加量、接种量、发酵温度为自变量，以SOD活力为响应值绘制响应面曲线，确定最佳试验条件。Box-Behnken 试验因素与水平设计见表1。

1.5 分析方法

SOD活力测定：采用邻苯三酚自氧化法对试验中SOD的活性进行测定[9-10]。SOD酶活定义：在1 mL反应液中，1 min抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为1个活力单位（U）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 糖的添加量对SOD活性的影响。

由图1可知，SOD活力随着糖添加量的增加而升高，当糖的添加量超过50%时，酶活力开始下降。同时，可以看出糖的添加量在40%～60%范围内对酶活力的影响显著，因此选择此范围内的接种量作为Box-Behnken响应面试验的影响因子。

2.1.2 菌种比例对SOD活性的影响。

由图2可知，在酵母菌逐渐增加、乳杆菌逐渐减少的配比下，酶活力随酵母菌比例的升高而增大，当酵母菌和乳杆菌的比例为2∶3时，SOD活力达到最大，酵母菌比例继续增加时，酶活力反而有缓慢下降的趋势。从菌种比例对SOD活力的影响来看，当酵母菌的菌种增加到2∶3之后时，其酶活力变化不大，所以不选择此因子进行Box-Behnken响应面试验，同时确定最佳的菌种比例（酶母菌∶乳杆菌）为2∶3。

2.1.3 接种量对SOD活性的影响。

由图3可知，发酵液中SOD活力随着菌种接种量的增加而增加，当接种量为4%时SOD活力达到最高值，随后出现下降趋势。可能是因为接种量过大，发酵产物显著减少，因此，选定接种量在3%～5%的范围进行下一步Box-Behnken响应面试验。

2.1.4 发酵温度对SOD活性的影响。

由图4可知，SOD活力随着培养温度的升高而增大，当培养温度超过34 ℃时，酶活力开始下降。同时，可以看出培养温度在32～36 ℃范围内对酶活力的影响较显著，因此选择此范围的发酵温度作为Box-Behnken响应面试验的影响因子。

2.1.5 发酵时间对SOD活性的影响。

由图5可知，SOD活力随发酵时间的延长先增加后降低。在发酵初期SOD活性较小，发酵60 d后酶活开始逐渐上升；当发酵时间为90 d时，酶活力达到最大值。然而，当发酵时间超过90 d后，酶活力却有下降趋势。原因可能是发酵后期菌体处于衰亡期导致营养物质被大量消耗，但又未及时补充，抑制了SOD的不断积累。所以，选择发酵时间为90 d。

2.2 响应面试验结果

按照“1.4.2”方法进行试验，结果见表2。采用Design Expert 7.0软件，对表2中的试验数据进行处理，得到回归方程，方差分析结果如下：

由方差分析可知，该试验所建立的二次多项模型具有高度的显著性（P模型<0.000 1），失拟项不显著（P>0.05），校正决定系数R2Adj为0.966 0，表明有約96.60% 的SOD活力由此模型进行解释；方程的决定系数R2为0.985 1，表明仙人掌酵素发酵中SOD活力变化建立的方程对试验的拟合优度较好。各自变量试验因素对响应值的影响如下：因素 A（糖的添加量）和C（发酵温度）对SOD活力的影响均极显著（P<0.01），因素B（接种量）对SOD活力的影响显著（P<0.05）。

二次项因素A2、B2和C2均极显著（P<0.01），具有显著的曲线关系。BC（接种量与发酵温度）对SOD活力有极显著（P<0.01）的交互影响。模型的F值可以反映各因素对试验响应值的重要性，F值越大，表明对试验响应值的影响越大，重要性越大[11]。可见，各因素对SOD活力的影响程度大小顺序为糖的添加量>发酵温度>接种量。

为直观表现2个因素对SOD活力的影响，可固定一个因素的值，分析另外2个因素对响应值的影响。图6可反映各因素交互作用对响应值的影响，等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示2个因素交互作用显著，而圆形则与之相反。可见，糖的添加量和接种量及糖的添加量和发酵温度的交互作用不显著，接种量和发酵温度的交互作用极显著。同时，3个响应面均为凸型曲面，表明SOD活力存在极高值。根据对SOD活力的二次多项方程求解，得到最佳的仙人掌酵素发酵工艺条件：糖的添加量 55.3%、接种量4.1%、发酵温度34.42 ℃，在此最佳条件下，SOD活力理论上可达324.14 U/g。

考虑试验可操作性，修正最佳工艺条件为糖的添加量 55.0%、接种量4.0%、发酵温度34.0 ℃，在此条件下，连续进行3组平行试验进行验证，实际测得SOD活力的平均值为 323.21 U/g，与理论预测值的相对误差为 0.3%，说明模型拟合性良好，验证了模型的有效性。该二元多项回归方程为仙人掌酵素发酵工艺提供了一个合适的模型。

3 结论

笔者在单因素试验的基础上，采用响应面分析法，对仙人掌酵素发酵的工艺条件进行了优化，获得的最佳配方为糖的添加量 55.0%、接种量4.0%、发酵温度34.0 ℃，在此最佳条件下，SOD活力可达 323.21 U/g。该仙人掌酵素的发酵工艺在工业化生产中具有一定的指导意义。

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