珍稀濒危植物银缕梅ISSR—PCR反应体系建立及优化

陈云霞　路志远　肖卓恒

摘要[目的]建立和优化银缕梅ISSR—PCR反应体系。[方法]采用正交试验和单因子试验对影响PCR扩增体系中的Mg²⁺浓度、dNTPs模板DNA及引物浓度、Taq酶用量5个因子进行分析研究。[结果]银缕梅ISSR-PCR25μL反应体系中5个因子最优水平：DNA模板（20ng/μL）2.50μL，引物（10μmol/L）1.00μL，Taq酶（5U/μL）0.10μL，Mg²⁺（25mmol/L）3.00μL，dNTPs（2.5mmol/L）1.50μL。[结论]银缕梅ISSR-PCR反应最优体系的建立为进一步利用ISSR对其进行分子标记辅助育种、分子指纹图谱构建和遗传多棒性分析等后续研究奠定了基础。

关键词 银缕梅；ISSR；PCR反应体系；资源保护

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）11-0081-03

银缕梅（Parrotiasubaequalis）是仅存于我国被再发现的“活化石”树种，也是我国特有的单种属乔木树种，在植物进化史上有着承前（裸子植物）启后（被子植物）的重要地位。银缕梅是一种珍贵的兼具观花和秋季观叶的优良绿化观赏树种。但由于其分布区狭小，呈间断岛屿状散布于天目山北段及大别山东南部，现存种群个体数量极少，已濒于灭绝，1999年被列入《国家一级重点保护野生植物名录》，并被国际自然保护联盟（IUCN）列为极度濒危（criticallyendan-gered，CR）物种。面对如此严峻的形势，对银缕梅遗传多样性的研究与分析，制定更具针对性的种质资源保护策略非常迫切。

简单重复序列区间扩增（inter-simplesequencerepeats，IS-SR）是在微卫星技术基础上发展起来的一类分子标记技术。ISsR技术以其多态性好、成本低、操作简单、所需DNA模板含量少等特点备受青睐，其在植物种质资源收集和鉴定、遗传多样性和亲缘关系及基因定位等方面被广泛应用。

近年来针对银缕梅开展的研究工作虽然比较活跃，但大多数研究还是集中于形态解剖、系统分类、生理生态、生物学特性及繁殖培育等方面，在分子水平的研究几乎空白。笔者通过正交试验和单因子试验，分析模板DNA、Taq酶、引物、Mg²⁺和dNTPs5个因子对银缕梅ISSR-PCR反应的影响，建立银缕梅最佳ISSR-PCR反应体系，以期为利用ISSR标记对其进行分子标记辅助育种、分子身份证构建和遗传多样性分析等后续研究奠定基础。

1材料與方法

1.1材料 银缕梅植物材料采自江苏省宜兴林场大垅沟，植物叶片采用硅胶.陕速干燥保存。

1.2方法

1.2.1银缕梅DNA提取。将0.1g银缕梅叶片剪碎，先用液氮处理再用研钵研磨粉碎，用DNeasyPlantMiniKit植物基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）提取基因组。使用紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶电泳法对DNA的浓度和质量进行检测。

1.2.2银缕梅ISSR-PCR反应引物筛选。从加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的100个ISSR引物中随机选择16条引物（805、809、816、821、829、832、834、838、843、845、851、863、869、872、877、880）进行初筛选。初反应体系为25μL，其中Taq酶0.20μL，Mg²⁺2.00μL，DNA2.00μL，dNTPs2.00μL，引物1.00μL，MilliQ水17.80μL。

扩增的程序为95℃预变性10min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min，共36个循环；72℃延伸10min，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3银缕梅ISSR-PCR反应体系建立。对银缕梅IssR反应5因素（Taq酶、Mg²⁺、DNA、dNTPs、引物）进行4浓度梯度试验，共16个处理，建立银缕梅ISSR-PCR反应体系（表1）。

1.2.4银缕梅ISSR-PCR反应单因子试验设计。对正交试验建立的IssR-PCR反应体系进行单因子（Taq酶、Mg²⁺、DNA、dNTPs、引物）试验，分析不同因素对银缕梅ISSR-PCR反应的影响（表2）。

2结果与分析

2.1目标引物确定 经过对多态性、稳定性以及亮度的综合比较后，结果显示引物845的条带效果最好（图1）。因此选定引物845来进行银缕梅ISSR-PCR反应体系正交试验探索。

2.2银缕梅ISSR-PCR正交试验结果 对引物845进行5因素4梯度的正交试验（图2），发现16个处理中只有处理5和9没有扩增出条带。对有扩增条带的进行进一步比较，发现处理6条带最清晰、多态性较好，故选取处理6进行单因子试验。由表1可知，处理6的25μL反应体系中，DNA2.50μL（20ng/μL），Taq酶0.10μL（5U/μL），引物1.00μL（10μmoL/L），dNTPs1.50μL（2.5mmol/L），Mg²⁺3.00μL（25mmoL/L）。根据正交试验结果，设计出单因子试验浓度梯度（表2）。

2.3.1模板DNA浓度对银缕梅ISSR-PCR反应的影响。最优DNA模板浓度取决于物种基因组大小及DNA模板纯度。该研究比较了25μL反应体系中模板DNA4个浓度梯度2.00、2.50、3.00、3.50txL（20ng/μL）的扩增效果，发现在一般情况下，随着浓度的增加，条带亮度和多态性都会增强。因此银缕梅IssR—PCR体系模板DNA浓度在0.50～5.00μL（20ng/μL）时，2.50μL（20ng/μL）的效果最优。

2.3银缕梅ISSR-PCR单因子试验结果 图3为不同浓度的DNA、引物、dNTPs、Mg²⁺和Taq酶对银缕梅ISSR-PcR反应的影响。

2.3.2引物浓度对银缕梅ISSR-PCR反应的影響。引物浓度直接影响PcR结果的可靠性。浓度偏高可能会引起错配和非特异性扩增，浓度过低则可能无法检测出所有ISSR位点。试验设置了0.80、1.00、1.20、1.40μL（10μmoL/L）4个梯度。由图3可知，浓度在1.00μL（10μmoL/L）时条带最多且清晰，所以该浓度是银缕梅ISSR—PCR体系的最适引物浓度。

2.3.3dNTPs浓度对银缕梅ISSR-PCR反应的影响。作为ISSR-PCR反应的原料，dNTPs浓度过高，会出现非特异性扩增条带；反之则影响合成效率。由图3可知，在浓度为1.50μL（2.5mmol/L）时扩增条带亮度和多态性最好，故银缕梅ISSR-PCR体系dNTPs最优浓度为1.50μL（2.5mmol/L）。

2.3.4Mg²⁺浓度对银缕梅ISSR-PCR反应的影响。Mg²⁺浓度对PCR扩增特异性和产物有显著影响。比较反应体系中2.60、3.00、3.40、3.80txL（25mmol/L）4个浓度电泳结果，当Mg²⁺浓度为3.00μL（25mmol/L）时条带多态性较丰富，因此银缕梅ISSR-PCR体系中最适Mg²⁺浓度应为3.00μL（25mmol/L）。

2.3.5Taq酶浓度对银缕梅ISSR-PCR反应的影响。Taq酶用量直接影响扩增反应成功与否，使用高浓度Taq酶易产生非特异扩增产物，但如果Taq酶浓度过低，则会导致产物合成效率下降。由图3可知，Taq酶浓度在0.05～0.50μL（5U/μL）时，以0.10μL（5U/μL）的效果最好。

3讨论与结论

ISSR-PCR是基于PCR反应的分子标记，具有稳定性好、多态性高的特点，建立稳定性好、扩增效率高的反应体系是开展后续研究的基础。ISSR反应体系容易受到模板DNA浓度和纯度、引物与dNTPs用量、Mg²⁺浓度、Taq酶浓度等因素的影响，为了保证ISSR-PCR反应结果的清晰、准确，必须对扩增条件进行优化。该试验先采用正交设计进行初筛选，再通过单因素进行优化，最终筛选出银缕梅ISSR-PCR的最佳反应体系，即25txL的反应体系中DNA模板2.50μL（20ng/μL），引物浓度1.00μL（10μmol/L），Taq酶浓度0.10μL（5U/μL），Mg²⁺浓度3.00μL（25mmoL/L），dNTPs浓度1.50μL（2.5mmol/L）。上述ISSR反应体系中，关键影响因子为引物浓度和Taq酶浓度。引物浓度不同，扩增片段大小会呈现很大差异，引物浓度越高，条带不清晰，且弥散增多。Taq酶浓度过高易产生非特异扩增产物，但如Taq酶浓度过低，则会导致产物合成效率下降。笔者首次针对银缕梅ISSR-PCR反应体系开展了研究，该研究结果为以后利用ISSR开展银缕梅遗传多样性及遗传结构进一步分析奠定了基础。