戊唑醇在苹果和土壤中的残留及消解规律研究

罗雪婷，吴 迪，潘洪吉，张宝常，王艳辉，张希跃，矫 健

(1.北京市植物保护站，北京 100029；2.北京市平谷区植物保护站，北京 101205)

图1 戊唑醇结构式Fig. 1 The structure of tebuconazole

戊唑醇(Tebuconazole)是一种高效、广谱、内吸性的三唑类杀菌农药(结构式见图1[1])，具有保护、治疗、铲除三大功能，目前在我国18种作物上取得登记[2]并广泛应用。其杀菌机理主要是抑制病原菌的麦角甾醇的生物合成，可以防治白粉菌属、柄锈菌属、喙孢属、核腔菌属和壳针菌属引起的病害。其杀菌性能与三唑酮相似，生物活性比三唑酮、三唑醇高，表现为用药量低[3]。然而，戊唑醇对肝脏与血液系统有一定的蓄积毒性[4]，还可能是一种非遗传毒性的动物致癌物[5]。戊唑醇对大鼠的急性经口LD50约为4 000 mg/kg，对雌、雄小鼠的急性经口LD50分别为3 933和2 000 mg/kg，对大鼠的急性经皮LD50>5 000 mg/kg[1]。因此，确定戊唑醇在苹果中的残留消解动态有非常重要的作用。

戊唑醇随着应用范围的扩大以及使用频率、用量、面积的增加，农药残留问题也日益凸显，尤其是近年来在苹果上登记使用防治苹果斑点落叶病的企业逐渐增多。为了保证消费者的安全，笔者根据现状对戊唑醇在苹果及土壤残留检测的方法进行了探索，并对其残留消解动态进行了研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试验品种。苹果(富士)。

1.1.2药剂与试剂。80%戊唑醇水分散粒剂(广西贝嘉尔生物化学制品有限公司)；乙腈、丙酮、环己烷、乙酸乙酯均为色谱纯，购自迪马公司；N-丙基乙二胺(PSA)，购自迪马公司；戊唑醇标准品：纯度99.5%，购自迪马公司；溴氰菊酯标准品：纯度99.5%，购自迪马公司；灭螨猛标准品：纯度99.0%，购自迪马公司；有机微孔过滤膜(孔径0.22 μm)，由Agilent公司生产。

1.1.3仪器。GPC-GC/MS 2010Ultra在线凝胶色谱串联气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)；高速组织捣碎机(德国 IKA T18)；恒温振荡器(培英 DDH7-300)；氮气吹干仪(美国Organomation Associates Jnc)；台式高速离心机(转速不低于5 000 r/min，长沙英泰仪TG16)；分析天平(感量0.01 g和0.000 01 g，德国sartoriusBP211D)。

1.2方法

1.2.1提取。称取20.00 g苹果样品，加入40 mL乙腈，用高速组织捣碎机在10 000 r/min转速下匀浆提取1 min，加入5 g氯化钠，再匀浆提取1 min，8 000 r/min离心5 min，使乙腈相和水相分层。

1.2.2净化。移取8 mL上清液于15 mL离心管中，加入0.2 g PSA，剧烈振荡1 min，将离心管放入离心机中，8 000 r/min离心5 min。吸取4 mL乙腈溶液置于5 mL离心管中，将离心管置于氮吹仪上，在水浴温度40 ℃条件下氮吹蒸发至近干(0.2 mL左右)，用乙酸乙酯定容至1.0 mL，过0.22 μm微孔滤膜，待GPC-GC/MS检测。

1.2.3仪器分析条件。

1.2.3.1GPC条件。色谱柱:ShodexCLNpak EV-200， 2.1 mm(直径)×150 mm；流动相:丙酮-环己烷混合溶液(3+7,V/V)；流速0.1 mL/min；柱温:40 ℃；进样量:10 μL。

1.2.3.2GC-MS条件。HP-5 ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；PTV进样模式；进样口温度程序： 120 ℃保持5 min，再以100 ℃/min速度升温至250 ℃并保持 31.7 min ；柱温程序：2 ℃保持5 min，再以8 ℃/min升温至300 ℃并保持4.2 min；载气：He；电子轰击源(EI)；离子源温度：200 ℃；接口温度：250 ℃；扫描开始时间：24 min，结束时间：32 min；扫描范围(m/z) 85～500。保留时间：27.174 min；选择离子：250、252、127、163。

1.3消解动态试验

1.3.180%戊唑醇水分散粒剂在苹果中的消解动态试验。选取苹果园内有代表性的地块，设3个重复试验小区，每小区面积20 m2，施药时期为苹果生长到成熟个体一半大小时施药，施药时应保证用于动态试验的苹果均匀着药。施药剂量为有效成分480 mg/kg(1 667倍稀释液)处理，施药后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、30 d、45 d取样。每个处理3次重复，处理间设保护隔离区，另设清水空白对照。随机在试验小区上、下、左、右不同部位采集12个(不少于2 kg)已着药、生长正常、无病害的果实，去梗，混匀后缩分，留250 g样品2份，分别装入封口样品容器中，于-20 ℃冰箱保存待测。

1.3.280%戊唑醇水分散粒剂在土壤中的消解动态试验。选一块20 m2的地块，单独施药，施药剂量为有效成分480 mg/kg(1 667倍稀释液)，施药后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、30 d、45 d取样。另设清水空白对照。随机取点10～12个，用土钻采集0～10 cm的土壤1～2 kg，除去土壤中的碎石、杂草和植物根茎等杂物，混匀后采用四分法留样300 g，装入封口样品容器中，粘好标签，贮存于-20 ℃冰柜中保存。

2 结果与分析

2.1提取溶剂的选择按溶剂类型划分，目前农残提取法主要有3种：第1种是乙腈法，美国、加拿大等国应用最早、最多；第2种是丙酮法，20世纪中后期在我国广泛应用；第3种是乙酸乙酯，欧盟国家及FAO、IAEA等机构使用很多。就农药提取效率来说，乙腈、丙酮、乙酸乙酯3种试剂中最优的为乙腈，丙酮毒性很低且是一种典型的溶剂，但是由于其极性较强，提取的杂质较多，为下一步净化带来困难，乙酸乙酯由于分子量较大，穿透力没有乙腈强[6]。戊唑醇的提取效果没有乙腈好，结合以上几点，试验最终选取乙腈为提取液。

2.2净化方法的选择QuEChERS方法是近年来国际非常流行的一种通用前处理方法，在2003年,Anastassiades等[7]首次报道了“QuEChERS方法” (Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe),该方法能够快速、简便、高质量地对农药多残留进行分析。国内残留检测中最早应用QuEChERS法的研究出现在2005年[8]。目前，已有200 余种农药残留可用该方法进行分析,其中包括含脂肪的介质体系[9-12]。QuEChERS方法将净化剂直接加入到提取液中,与传统的固相萃取法相比不仅节省溶剂,减少环境污染，同时也节约了大量的前处理时间。

试验以QuEChERS方法为基础，根据苹果相对糖分色素较多，机制复杂，结合检测效率，对QuEChERS方法进行了改良。对预处理后的样品经乙腈提取后，采用氯化钠盐析分层后，利用基质分散萃取机理，采用PSA吸附剂吸附基质中绝大部分干扰物(色素、糖分、有机酸、脂肪酸、碳水化合物等)，从而达到净化的目的。这样的前处理方式既满足了检测的需求，而且大大提高了检测速度，并且节约了大量的劳动成本。

2.3最终定容试剂的选择为了提高检出限，试验使用浓缩的处理方式，定容试剂选择乙酸乙酯，由于乙酸乙酯对糖和水的溶解度小于乙腈，在最终定容时进行溶剂转换，实现再一次净化。另外，由于乙腈和该研究GPC使用的溶剂环己烷不互溶，会产生比较严重的溶剂效应。因此，在最终定容时，用乙酸乙酯定容，不仅对样品进行了再一次净化，而且有效地避免了溶剂效应。

2.4仪器分析方法的选择目前有很多关于戊唑醇残留检测的方法，但前处理步骤相对较多，使用仪器大多为液相色谱、气相色谱、气相质谱联用仪[13-22]，另见González-Rodríguez等[23]采用GC-ITMS和LC-MS/MS检测葡萄酿酒过程中的戊唑醇残留。

由于该研究所用前处理采用分散固相萃取净化，净化效果没有传统的SPE法好[24]，在应用气相色谱-质谱检测时往往因出现衬管和柱前端严重污染而导致色谱峰丢失或拖尾、背景高、基质效应严重，从而影响了一些农药的定性和定量检测[25]。凝胶渗透色谱(GPC)能够很好地去除样品基质中的杂质，如油脂、色素(叶绿素、叶黄素等)、生物碱、聚合物等大分子化合物，并已在农药残留分析中得到广泛应用[26]。因此，选择GPC-GC/MS为检测仪器。GPC-GC/MS在分析农药残留时，在GPC色谱柱中根据体积排阻的原理将不同分子尺寸的物质进行分离，样品中分子量较大的脂肪和色素先从色谱柱中流出，通过六通阀的转换将这些基质干扰物排除系统，截取含有农药成分的部分导入试样定量捕集环路(200 μL)，再进行PTV进样和GC-MS分离检测，实现了全自动的前处理仪器分析测定的在线分析。而合理的截取时间是影响目标农药定性和定量的关键，若截取时间过早，色素和油脂的去除效果降低，截取时间过晚，分子量大的目标农药丢失，所以在GPC-GC/MS分析中必须根据实际分析对象选择最佳截取时间。该研究采用溴氰菊酯和灭螨猛标准品的保留时间来确定农药收集的开始和结束时间，需要测定的戊唑醇分子量为307.8，小于溴氰菊酯的分子量(505.2)[1]，所以采用溴氰菊酯的保留时间作为干扰物和分析对象的切割时间，图2为优化截取条件下农药的总离子流(TIC)色谱。此外，GPC-GC/MS系统的进样量为10～20 μL，比单独的GC-MS高5～10倍，样品提取液经分散固相萃取净化后再利用在线GPC进一步去除干扰物质，弥补了该研究所使用前处理去除干扰不彻底的缺陷，之后采用进样口程序升温的方式提高检测灵敏度和选择性，从而获得更低的检出限。

2.5质谱扫描方式的选择质谱仪扫描方式有全扫描和选择离子扫描2种。该研究采用全扫描定出目标物戊唑醇的保留时间。为了避免基质干扰，提高检出限，根据全扫的戊唑醇标品棒状图(图3)定出戊唑醇的特征离子为250、252、127、125。

图2 优化截取条件下农药的总离子流(TIC)色谱Fig.2 TIC chromatographic of pesticide under optimized intercept condition

图3 全扫的戊唑醇标品棒状图Fig.3 A bar chart of tebuconazole standard according to full scan

2.6标准曲线、线性范围及检出限称取99.5%戊唑醇标准品10.70 mg，用乙酸乙酯溶解至10 mL，得到1 000 mg/L的母液。逐级稀释，用空白基质配制0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000、2.000、5.000、10.000 mg/L系列标准溶液，在上述仪器条件下进行测定，以戊唑醇标准溶液浓度与其峰面积做标准曲线(图4)。标样线性方程为：y=1 362 381.0x+309 163.2，相关系数r=0.999。其中,y为戊唑醇响应值，x为标准溶液浓度。结果表明，戊唑醇标准溶液浓度在0.020～10.000 mg/L内与峰面积呈良好的线性关系。

2.7灵敏度、准确度与精确度该方法对戊唑醇的最小检出量为2×10-11g，在苹果和土壤样品中最低检测浓度均为0.02 mg/L。分别在空白苹果样品中添加4档浓度的戊唑醇标准溶液，每档重复5次，用上述分析方法测定回收率。由表1、2

可知，苹果和土壤中添加0.02、0.20、2.00和4.00 mg/kg， 回收率在75%～109%，相对标准偏差为3.1%～9.4%。

图4 戊唑醇标准曲线Fig.4 The standard curve of tebuconazole

%

表2 土壤中戊唑醇的添加回收率

2.8方法净化效果通过前处理和GPC-GC/MS仪器本身自带的净化功能相结合，处理苹果、土壤空白样品和添加样品，在分析过程中排除了杂质干扰，说明该方法有良好的净化效果(图5～8)。

图5 苹果空白样品图谱Fig.5 Spectrogram of apple blank sample

图6 苹果添加0.2 mg/kg戊唑醇样品色谱Fig.6 Spectrogram of apple sample added 0.2 mg/kg tebuconazole

图7 土壤空白样品色谱Fig.7 Spectrogram of soil blank sample

图8 壤添加0.2 mg/kg戊唑醇样品色谱Fig.8 Spectrogram of soil sample added 0.2 mg/kg tebuconazole

2.9残留消解动态结果戊唑醇在苹果中的消解动态方程为Y=0.7e-0.05X，半衰期为13.9 d(表3)，消解动态曲线见图9；戊唑醇在土壤中的消解动态方程为Y=0.279e-0.01X，半衰期为34.7 d(表4)，消解动态曲线见图10。

表3 戊唑醇在苹果中的消解动态

图9 戊唑醇在苹果中的消解动态曲线Fig.9 The dynamic curve of tebuconazole digestion in apple

3 结论与讨论

试验以传统的QuEChERS前处理法为基础，直接使用乙腈作为提取液，减少了酸对PSA除杂能力的影响。另外，除水采用了氯化钠盐析法替代了无水硫酸镁，减少了因为无水

表4 戊唑醇在土壤中的消解动态

图10 戊唑醇在土壤中的消解动态曲线Fig.10 The dynamic curve of tebuconazole in soil

硫酸镁除水产生结块并释放大量热量而对农药提取的损失；使用乙酸乙酯作为最终定容试剂进行溶剂转换，实现了再一次净化，并且减少了GPC的溶剂效应；选用GPC-GC/MS作为检测仪器，不仅提高了检测灵敏度而且再一次进行了在线净化。

我国规定苹果中戊唑醇的MRL值为2.0 mg/kg[27]，在确保戊唑醇得到安全使用的前提下，采用80%戊唑醇水分散粒剂防治苹果白腐病时，建议用量为48～75 mg/kg(4 000～6 000倍液)，喷雾施药3～4次，施药间隔7 d，推荐的安全间隔期为21 d。

[1] MACBEAN C.农药手册[M].原著第16版著.胡笑形，等译.北京：化学工业出版社，2015:955-957.

[2] 农药电子手册[DB/OL](2006-02-23)[2017-11-15].http:www.ampcn.com/trade/detail/11086.asp.

[3] 袁会珠,李卫国.现代农药应用技术图解[M].北京：中国农业科学技术出版社，2013:240-242.

[4] 杨秀鸿，安飞云，陆丹.戊唑醇原药诱变性与亚慢性经口毒性的实验研究[J].实用预防医学，2010,17(10):2084-2087．

[5] BOMHARD E．HWG 1608-toxic dose range carcinogenicity study in NMRI mice(supplement to study T601 8953 with ad ministration in diet over a 21-month period)[R].Unpublished Report Ref，1991．

[6] 钱传范,刘丰茂,潘灿平.农药残留分析原理与方法[M]. 北京：化学工业出版社，2011:47-48.

[7] ANASTASSIADES M,LEHOTAY S J,STAJNBAHER D,et al. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the deter mination of pesticide residues in produce[J]. Journal of aoco international,2003,86(2):412-431.

[8] 于彦彬，万述伟，谭培功，等. PSA 分散固相萃取液相色谱荧光法测定蔬菜和水果中的灭定威[J]. 分析测试学报，2005，24(5)：75-77.

[9] SCHENCK F J,HOBBS J E. Evaluation of the quick,easy,cheap,effective,rugged,and safe (QuEChERS)approach to pesticide residue analysis[J].Bull Environ Contam Toxicol,2004,73(1):24-30.

[10] LEHOTAY S J，KOK A D，HIEMSTRA M，et al.Validation of a fast and easy method for the deter mination of residues from 229 pesticides in fruits and vegetables using gas and liquid chromatography and mass spectrometric detection[J].Journal of aocc international,2005,88(2):595-614.

[11] LEHOTAY S J,MASTOVSKK,YUN S J.Evaluation of two fast and easy methods for pesticide residue analysis in fatty food matrixes[J].Journal of aocc international,2005,88(2):630-638.

[12] LEHOTAY S J,MASTOVSKK,LIGHTFIELD A R.Use of buffering and other means to improve results of problematic pesticides in a fast and easy method for residue analysis of fruits and vegetables[J].Journal of aocc international,2005,88(2):615-629.

[13] 梁菁.戊唑醇在小麦地土壤中的残留消解及其光化学降解的研究[D].长沙: 湖南农业大学，2009．

[14] 汤婕，岳永德，汤锋，等.香蕉中戊唑醇残留分析方法的比较研究[J].安徽农业大学学报，2008，35(2):275-279．

[15] 陈莉，陈家梅，戴荣彩，等.戊唑醇在苹果和土壤中的残留分析方法[J].农药科学与管理，2005，26(6):10-12．

[16] 刘军，沈菁，刘建.分散固相萃取- 高效液相色谱- 质谱联用法测定水稻秸秆、糙米、稻壳和土壤中戊唑醇残留[J]．分析科学学报，2010，26(1):55-58．

[17] 吴琼，林靖凌，张月，等.GC-MS 法测定香蕉及土壤中戊唑醇残留量[J].安徽农业科学，2012，40(30):14779-4781，14813.

[18] 赵永刚，章勇，张蓓蓓，等.固相萃取/高效液相色谱法测定水体中的戊唑醇[J].农药，2008，47(4):271-272．

[19] 王继军，黄士忠，陈志永，等.戊唑醇25 %可湿性粉剂在花生和土壤中的残留动态研究[J].中国农学通报，2009，25(17):255-259.

[20] 陈莉，戴荣彩，陈家梅，等.戊唑醇在苹果和土壤中的残留动态[J].农药，2007，46(3):194-196．

[21] 孙明娜，段劲生，王梅，等.戊唑醇在葡萄和土壤中的残留和消解动态[J].农药学学报，2013，15(1):73-78．

[22] 孙慧．戊唑醇的气相色谱分析方法及其在大豆和土壤中消解动态研究[D].长春: 吉林农业大学，2011．

[24] HERCEGOV A,KRUZ D,MATISOV E.Comparison of sample prepration methods combined with fast gas chromatography-mass spectrometry for ultratr ace analysis of pesticide residues in baby food[J].J Sep Sci,2006,29(8):1102-1109.

[25] 卢大胜，熊丽蓓，温忆敏，等.QuEChERS前处理方法联合GPC-GC/MS在测定蔬菜水果农药残留中的应用[J]．质谱学报，2011,32(4):229-235.

[26] LIU L B,HASHI Y,QIN Y P,et al.Development of automated online gel permeation chromatography-gas chromatograph mass spectrometry for measuring multiresidual pesticides in agricultural products[J].Journal of chromatography B,2007,845(1):61-68.

[27] 国家卫生和计划生育委员会.食品中农药最大残留限量:GB2763—2016[S]．北京: 中国标准出版社，2016．