复配抗氧化剂在石榴籽油中的抗氧化活性

熊峰 李云云 国海东 李郅颖 林盛聪 罗安东

摘要 通过乙醇-水杨酸的体外抗氧化模型、等辐射分析方法及石榴籽油的加速氧化试验，研究了迷迭香提取物、L-抗坏血酸棕榈酸酯、茶多酚和茶多酚棕榈酸酯等抗氧化剂之间的协同作用。结果表明，抗氧化剂之间的协同性受其组成和比例的影响，迷迭香提物体与L-抗坏血酸棕榈酸酯、茶多酚棕榈酸酯在不同比例下分别表现出协同性和拮抗性，迷迭香提取物与茶多酚在不同的比例下均表现出协同性，且两者间的比例为1∶9时，协同性最高（37.62%），此时在石榴籽中的抗氧化效果与TBHQ相当。

关键词 抗氧化剂;等辐射分析法;协同作用;石榴籽油

中图分类号 TQ 911文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）23-0190-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.055

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Antioxidant Activity of Compound Antioxidants in Pomegranate Seed Oil

XIONG Feng， LI Yun yun， GUO Hai dong et al

（Guangzhou Honsea Sunshine Biotech Co.， Ltd.，Guangzhou， Guangdong 510530）

Abstract Synergistic effects between antioxidants such as rosemary extract， L ascorbyl palmitate， tea polyphenols and tea polyphenol palmitate were investigated by the in vitro antioxidant model of ethanol salicylic acid， the isobolographic analysis and the accelerated oxidation test of pomegranate seed oil. The results showed that the composition and ratio of compound antioxidants showed different synergy. The L ascorbic acid palmitate and tea polyphenol palmitate with rosemary extract showed synergy and antagonistism at different ratios， respectively. The rosemary extract with tea polyphenols showed synergy at different ratios， and when the ratio between the two was 1∶9， the synergy was the highest （37.62%）， and the antioxidant effect in pomegranate seeds could be equivalent to TBHQ.

Key words Antioxidant;Isobolographic analysis method;Synergistic effect;Pomegranate seed oil

石榴（Punica granatum L.）是石榴科石榴屬植物，分布在我国亚热带及温带地区，其籽含油率高达20%以上。石榴籽油是一种植物源的多不饱和共轭脂肪酸，主要成分为石榴酸，含量高达60%～85%[1]，具有较好的抗氧化性、抗癌、增强免疫力、预防动脉粥样硬化等药理作用，被广泛用于保健食品与医药领域[2-5]。但石榴酸由于独特的共轭三烯结构，易在光、空气、热及水分等因素作用下发生酸败，使石榴籽油的口感、风味和营养价值受到极大影响。为了减缓或预防石榴籽油的氧化变质，加入抗氧化剂是提高石榴籽油贮藏稳定性的一种有效方式。

合成抗氧化剂如BHT（二丁基羟基甲苯）、BHA（叔丁基羟基茴香醚）和TBHQ（叔丁基对苯二酚）等由于具有产量大、价格低、抗氧化较强的优点，长期以来一直是食品抗氧化剂市场的主流产品。但近年来研究表明，BHT、BHA与TBHQ具有一定的毒性和致癌作用[6]，欧盟和日本等已经禁止或限制这类型抗氧化剂在食品加工中使用[7]。寻找更加安全、健康、绿色的抗氧化剂已成为食品加工领域的趋势。

该研究参考GB 2760—2007《食品添加剂使用卫生标准》，利用4种抗氧化剂复配一款在石榴籽油中抗氧化性能与TBHQ相当的复配抗氧化剂，并为其他油脂深加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石榴籽油，广州合诚三先生物科技有限公司自制，初始过氧化值为0.75 mmol/kg。抗氧化剂：迷迭香提取物（鼠尾草酸≥20%，广州合诚三先生物科技有限公司）、茶多酚（TP≥95%，浙江天草生物科技有限公司）、L-抗坏血酸棕榈酸酯（东莞市感恩食品科技有限公司）、茶多酚棕榈酸酯（成都华高生物制品有限公司）、THBQ（广东大地食用化工有限公司），其他试剂均为国产分析纯。

UV Blue star B型紫外可见分光光度计（北京莱伯泰科技仪器有限公司）;DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）;HHS-21-4型恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;PRECISA125A型电子天平（瑞士普利赛斯）。

1.2 方法

油脂的氧化过程主要为酶促氧化、光氧化和自动氧化，其最主要过程为自动氧化[8]。光氧化是通过自由基引发油脂氧化的链式反应，从而加速油脂的氧化，通过抑制油脂中自由基的链式反应能显著延长油脂的保质期。通过建立乙醇-水杨酸的体外抗氧化模型评价复配抗氧化剂的自由基清除能力，从而间接评价复配抗氧剂在油脂中的抗氧化活性。

1.2.1 自由基清除率测定。

取1 mL的FeSO4溶液（10 mmol/L）于试管中，加入1 mL的水杨酸-乙醇溶液（10 mmol/L），摇匀后加入1 mL复配抗氧化剂已知浓度的样品液，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL启动反应，37 ℃，水浴1 h，冷却至室温，在波长510 nm处测吸光度。在其他条件不变下，以TBHQ替换复配抗氧化剂作为阳性对照[9]。则羟基自由基（·OH）清除率计算公式如下：

K=[1-（A1-A2）/A3] ×100%（1）

式中，A1为无水乙醇代替复配抗氧化剂作为空白;A2为样品液;A3为无水乙醇代替H2O2的样品本底溶液。

1.2.2 等辐射分析法。

等辐射分析法（isobolographic analysis）是一种简单、精准分析药物之间相互作用的方法，现广泛用于药物协同作用的定性与定量方面研究[10-11]。采用等辐射分析法研究迷迭香提取物分别与茶多酚、茶多酚棕榈酸酯、L-抗坏血酸棕榈酸酯等抗氧化剂复配后的协同作用。以迷迭香提取物、茶多酚、茶多酚棕榈酸酯和L-抗坏血酸棕榈酸酯单独对自由基清除率的IC50作为参考值，按照表1所示比例进行复配试验，计算复配组的清除率及IC50。

1.2.3 统计分析。

对复配抗氧化剂之间协同作用进行统计学分析，利用GraphPad Prism回归分析绘制浓度-效应曲线，求得IC50，并根据Luszczki等[12]方法，由相加等效公式（2）分别计算复配抗氧化剂的理论值IC50add。

IC50add=IC50AP1+R×P2（2）

式中，R为A、B这2种抗氧化剂单独使用时的效价比，即R=IC50A/IC50B;P1为抗氧化剂A在復配组所占比例;P2为抗氧化剂B在复配组所占的比例，P1=1-P2;由试验得到复配组实际IC50mix值，若IC50mix值小于IC50add值，表示相互作用为协同作用，且协同率计算公式如下：

Y=IC50add-IC50mixIC50add×100%（3）

1.2.4 石榴籽油加速试验。

分别取50 g石榴籽油置于透明、统一规格的试剂瓶中，按照石榴籽油质量的 0.02%添加复配抗氧化剂，与石榴籽油混合均匀后，置于温度（60±1）℃的鼓风干燥箱中，进行21 d加速试验，并计算POV值，TBHQ作为阳性对照。POV值的测定参考GB 5009.227—2016 《食品安全国家标准食品》中过氧化值的测定。

1.2.5 数据处理。

数据采用GraphPad Prism6.0软件进行统计分析和绘图，·OH清除率的IC50值采用SPSS22.0进行计算，试验组值与空白组值采用one-way ANOVA分析，以P<0.05表示统计学显著性差异。

2 结果与分析

2.1 几种抗氧化剂清除能力比较

迷迭香提取物、L-抗坏血酸棕榈酸酯、茶多酚、茶多酚棕榈酸酯及TBHQ对·OH清除能力如图1所示。在浓度为0.2～2.0 mg/mL下，5种抗氧化剂对·OH的清除率与浓度剂量呈正相关，当浓度达2.0 mg/mL时，迷迭香提取物、L-抗坏血酸棕榈酸酯、茶多酚、茶多酚棕榈酸酯及TBHQ对·OH清除率为61.69%、99.3%、78.30% 、64.27%和96.78%，其IC50值分别为1.52、0.96、0.82、1.57和0.48 mg/mL，IC50值越低，其消除效果越好。

2.2 等辐射分析法分析复配抗氧化剂之间的协同作用

采用GraphPad Prism6.0软件将按照表2所测复配抗氧化剂的IC50值绘制在等辐射图上，再将两抗氧化剂单独作用的IC50值和95%的置信区间分别绘制于坐标轴上。复配点的IC50值落在相加效应线上或置信限内，则表示两抗氧剂间的作用为相加;若落在相加效应线的置信限左侧，则为协同作用;若落在右侧，则为拮抗作用[13]。

由图2和表2可知，在乙醇-水杨酸模型中，迷迭香提取物与茶多酚在不同的复配比例下均表现出协同作用，复配比例为1∶9时，表现出最高的协同作用（协同率37.62%）;迷迭香提取物与茶多酚棕榈酸酯、L-抗坏血酸棕榈酸酯的部分比例表现出协同作用，复配比例为1∶9时，迷迭香提取物与茶多酚棕榈酸酯表现出最高的协同作用（协同率20.79%），复配比例为9∶1时，迷迭香提取物与L-抗坏血酸棕榈酸酯表现出最高的协同作用（协同率20.79%），同时，也有部分复配比例表现出拮抗作用，如迷迭香提取物与茶多酚棕榈酸酯比例为3∶7（协同率-79.64%）、迷迭香提取物与L-抗坏血酸棕榈酸酯比例为7∶3（协同率-60.30%）。

2.3 石榴籽油的加速试验结果分析

根据上述等辐射分析结果，分别选取不同复配组合的最佳比例（迷迭香提取物与茶多酚比例为1∶9、迷迭香提取物与茶多酚棕榈酸酯比例为9∶1、迷迭香提取物与L-抗坏血酸棕榈酸酯为9∶1），采用Schaal法进行21 d的石榴籽油加速氧化试验，TBHQ为阳性对照，试验结果如图3所示。

在等量添加的情况下，随着加速时间的延长，各试验组的POV值均呈现上升的趋势。空白对照组的POV值上升最快，阳性对照组（TBHQ）上升最慢，迷迭香提取物+茶多酚复配组的上升趋势与阳性对照基本吻合，迷迭香提取物+茶多酚和迷迭香提取物+L-抗坏血酸棕榈酸酯复配组的上升趋势介于空白与阳性对照之间。对各试验组与空白组的POV值进行t检验，P值均小于0.01，与空白对照组存在显著性差异，说明添加抗氧化剂能显著抑制石榴籽油的氧化作用。在21 d时，迷迭香提取物+茶多酚复配组的POV值为9.74 mmol/kg（2.4 g/kg），接近TBHQ的POV值9.03 mmol/kg（2.3 g/kg），未超过GB 2716—2018食用油要求POV的限值2.5 g/kg，表明该复配组在石榴籽油中的抗氧化性能与TBHQ相当，且延长石榴籽油的货架期。

3 结论

该研究通过建立乙醇-水杨酸自由基清除模型，采用等辐射分析法对迷迭香提取物、L-抗坏血酸棕榈酸酯、茶多酚和茶多酚棕榈酸酯等复配组分及比例之间的协同抗氧化能力进行研究，结果显示4种抗氧化剂间的复配组分及比例对其抗氧化能力均具有显著性影响，其中协同效应最强组合是迷迭香提取物与茶多酚比例为1∶9，且该组合石榴籽油中的抗氧化性能与TBHQ相当。

不同的油脂所含不饱和脂肪酸程度不同，且同一抗氧化剂对不同饱和度的油脂抗氧化效果也存在差异。该研究复配组仅在石榴籽油中开展验证，该复配组能否替代THBQ在其他油脂中应用还有待进一步研究。

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