翡翠贻贝降血压肽酶解制备工艺研究

安婷婷 陈丽美 邓长春

摘要 [目的]研究翡翠贻贝蛋白酶解的工艺条件，为后期开发保健食品和药品提供基础。[方法]以ACE抑制率为指标，在单因素的基础上通过正交试验研究温度、pH、料液比和酶与底物的质量比确定酶解工艺。最后以ACE抑制率和水解率2个指标研究酶解时间。[结果]最佳酶解工艺为：碱性蛋白酶，酶解温度为50 ℃，酶解pH为9.5，料液比为1∶4（g∶mL），酶与底物质量比为1%，酶解时间为2 h。[结论]碱性蛋白酶可以酶解翡翠贻贝得到翡翠贻贝降血压肽，此酶解方法简单、可行。

关键词 翡翠贻贝;降血压肽;酶解工艺;正交试验

中图分类号 R282.77  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）10-0137-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.037

Abstract [Objective]To study the conditions of enzymatic hydrolysis of Perna viridis， which provided a basis for the later development of medicine and health food.[Method]The temperature， pH， solidliquid ratio，mass ratio of enzyme to substrate on enzymatic hydrolysis process was studied to obtain enzymolysis technology by orthogonal experiment on the basis of single factor experiment.Finally， the time of enzymatic hydrolysis was studied by monitoring the ACE inhibition rate and hydrolysis rate.[Result]The optimal enzymatic conditions of alkaline proteade were the temperature 50 ℃， pH 9.5， solidliquid ratio 1∶4（g∶mL），mass ratio of enzyme to substrate 1%，emzymolysis time was 2 h.[Conclusion]The alkaline protease can hydrolyze Perna viridis to obtain the antihypertensive peptide of Perna viridis. This method is simple and feasible.

Key words Perna viridis;Antihypertensive peptide;Enzymolysis technology;Orthogonal experiment

血管緊张素转化酶抑制肽（angiotensin converting enzyme inhibitory peptides）是一种对 ACE 活性具有抑制作用的多肽类物质，一般由 2～20 个氨基酸残基组成，一般是由蛋白质酶解而得，其通过抑制血管紧张素转换酶（ACE）的活性，阻碍血管紧张素Ⅱ的生成以及抑制血管舒缓激肽的分解而达到降血压的作用[1-3]。由于蛋白酶的酶切位点不固定，酶切后得到的多肽也是多种多样的。翡翠贻贝（Perna viridis（Linnaeus）），又名绿壳菜蛤、淡菜或青口螺，广泛分布于东海南部和南海，容易人工养殖，繁殖能力很强，产量高，含有丰富的蛋白质、牛磺酸等[4]，其中粗蛋白含量占鲜肉重的9.27%、干肉重的52.31%[5]。该研究以去壳的翡翠贻贝为原料，以水解度和ACE抑制率为指标，其中，高效液相法评价ACE[6]抑制率，pH-stat法[7]测定水解度。首先通过比较4种蛋白酶对翡翠贻贝的酶解效果，确定最佳用酶，然后通过单因素试验，设计优化出碱性蛋白酶水解翡翠贻贝制备ACE抑制肽的最佳反应条件。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

中性蛋白酶（山东西亚化学工业有限公司）;碱性蛋白酶（山东西亚化学工业有限公司）;胃蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司）;胰蛋白酶（山东西亚化学工业有限公司）;马尿酸（山东西亚化学工业有限公司）;硼砂（天津市永大化学试剂有限公司）;硼酸（广州化学试剂厂）;TFA（三氟乙酸，广州化学试剂厂）;无水乙醇（广州化学试剂厂）;氢氧化钠滴定液（深圳市博林达科技有限公司）;氢氧化钠（广州化学试剂厂）;氯化钠（广州化学试剂厂）;乙酸乙酯（西陇科学股份有限公司）;盐酸（广州化学试剂厂）;乙腈（TEDIA）;血管紧张素转化酶（ACE，上海源叶生物科技有限公司）;翡翠贻贝（琼海采集）;马尿酰组胺酰亮氨酸（HHL，SIGMA）。

1.2 试验仪器

电子天平（BP211D，Sartorius）;电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）;循环水式多用真空泵（SHZ-95，巩义市予华仪器有限责任公司）;超声波清洗器（SK250HP，上海科导超声仪器有限公司）;台式高速冷冻离心机（TGL-16MC，长沙维尔康湘鹰离心机有限公司）;高效液相色谱仪（LC-2010AHT，岛津企业管理（中国）有限公司）;C18柱（YMC）;真空干燥箱（DZF-6050，山海博迅实业有限公司）;雷磁实验pH计（PHSJ-5，上海仪电科学仪器股份有限公司）;恒温磁力搅拌器（85-2，常州澳华仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 翡翠贻贝粗蛋白的制备。

新鲜翡翠贻贝清洁后去壳及足丝，留肉并切碎，匀浆，冷冻干燥，以1∶4（m/V）比例加入95%乙醇，50 ℃脱脂4 h，重复4次，真空干燥后，粉碎，得翡翠贻贝粗蛋白粉，置-20 ℃冰箱中冷藏备用。

1.3.2 ACE抑制率测定方法。

分别取表1所示体积的HCl、HHL、ACE抑制剂、硼酸盐缓冲液和ACE于同一离心管中，37 ℃下水浴反应35 min，后加入150 μL的1 mol/L HCl溶液终止反应，过滤，即得样品溶液、对照溶液和空白溶液。

取上述样品溶液、对照溶液和空白溶液各20 μL，HPLC测定马尿酸峰面积。色谱条件：色谱柱为C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：0.1%TFA乙腈∶0.1%TFA水，流动相时间程序如表2所示。检测波长228 nm[8];流速1.0 mL/min;进样量20 μL。

根据马尿酸峰面积计算翡翠贻贝酶解液的ACE抑制率：ACE抑制率=（A1-A2）/A1×100%，其中，A1为不加翡翠贻贝酶解液时马尿酸的峰面积，A2为加入翡翠贻贝酶解液时马尿酸的峰面积。

1.3.3 酶解工艺的研究。

1.3.3.1 酶的种类对ACE抑制率的影响。

称取翡翠贻贝粗蛋白5 g，溶于25 mL超纯水（料液比为1∶5），混合均匀，分别加入表3中4种酶0.1 g（酶与底物的质量比2%），按照表3所示酶解条件，0.5 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，并按照最适温度在恒温水浴锅中水浴2 h，酶解后，放入95 ℃水浴中10 min终止酶解反应，离心（4 000 r/min）15 min，取上清液，分别按“1.3.2”方法测定ACE抑制率测定马尿酸峰面积，并计算ACE抑制率。

1.3.3.2 pH对ACE抑制率的影响。

以ACE抑制率为指标，料液比为1∶5，碱性蛋白酶与底物质量比为2%，温度为50 ℃条件下酶解时间4 h，用0.5 mol/L NaOH分别调节pH为8.5、9.0、9.5、10.0、10.5酶解，取上清液，分别按“1.3.2”方法测定ACE抑制率。

1.3.3.3 温度对ACE抑制率的影响。

以ACE抑制率为指标，料液比为1∶5，碱性蛋白酶与底物质量比为2%，pH为9.5条件下酶解时间4 h，分别在45、47、50、52、54 ℃条件下酶解，取上清液，分别按“1.3.2”方法测定ACE抑制率。

1.3.3.4 料液比对ACE抑制率的影响。

以ACE抑制率为指标，碱性蛋白酶与底物质量比为2%，pH为9.5，温度50 ℃条件下酶解时间4 h，分别在料液比为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7条件下酶解，取上清液，分别按“1.3.2”方法测定ACE抑制率。

1.3.3.5 酶与底物的质量比对ACE抑制率的影响。

以ACE抑制率为指标，料液比为1∶5，pH为9.5，温度50 ℃条件下酶解时间4 h，分别在碱性蛋白酶与底物质量比为1%、2%、3%、4%、5%条件下酶解，取上清液，分别按“1.3.2”方法测定ACE抑制率。

1.3.3.6 翡翠贻贝ACE抑制肽酶解工艺条件优化。

根据单因素试验结果，以酶解温度、酶解pH、料液比、底物与酶质量比为考察因素，通过表4中L9（34）正交试验对酶解工艺设计进行优化。

1.3.3.7 水解时间对ACE抑制率的影响。

在料液比为1∶5，碱性蛋白酶与底物质量比为1%，pH为9.5，温度50 ℃条件下酶解时间4 h，酶解时用0.2 mol/L NaOH滴定维持pH恒定9.5，分别记录0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00 h的NaOH滴定量，取上清液，分别按“1.3.2”方法测定ACE抑制率。

同时计算每一个时间段翡翠贻贝粗蛋白的水解度，水解度的计算公式如下：

DH=B×NbMP×1α×1htot×100%

其中，B为NaOH的滴定量;Nb为滴定所用的NaOH的浓度;MP为底物中蛋白质的总量;htot为每1 g原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，在该作用条件下取7.77 mmol/g;α取0.44。

2 结果与分析

2.1 酶的种类对ACE抑制率的影响

按“1.3.3.1”所述进行试验，结果如图1所示。酶的种类不同，其底物特异性及作用位点也不同，不同的酶对于同一种蛋白质酶解得到产物的组成、结构和功能也不同。目前研究表明，肽链C末端是脯氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸或者序列中含有疏水性氨基酸是维持高ACE抑制活性所必需[1，9]。碱性蛋白酶对疏水性氨基酸-COOH具有底物特异性[10]，此试验碱性蛋白酶的活性最高，达100%。因此，该试验的4种酶中选择碱性蛋白酶为最佳用酶。

2.2 pH对ACE抑制率的影响 

按“1.3.3.2”所述进行试验，结果如图2所示。在pH为8.5～9.5时，ACE抑制率随着pH的增大而增加，ACE抑制率高达85.16%;而在9.5～10.5时，ACE抑制率反而随着pH的增加而减小，即碱性蛋白酶的活性与所处环境pH有关，越接近最适pH，酶的活性越强，当pH超过最适pH时，碱性蛋白酶逐渐失活。因此，确定此试验的最适pH为9.5。

2.3 温度对ACE抑制率的影响 按“1.3.3.3”所述进行试验，结果如图3所示。在45～50 ℃时，酶活性随着温度的升高，ACE抑制率增大，在50 ℃时活性最强，而超过50 ℃温度继续升高，酶活性反而降低。温度对酶活性的影响至关重要，在最适温度前，酶活性随着温度的升高而增大，而后随着温度的升高，酶逐渐失活，ACE抑制率降低。所以，該试验的最佳反应温度为50 ℃。

2.4 料液比对ACE抑制率的影响 

按“1.3.3.4”所述进行试验，结果如图4所示。随着料液比的增加，ACE抑制率明显增加，当料液比为1∶5时，ACE抑制率达到最大值，为83.3%，当料液比继续增大时，抑制率反而略微降低，推测为底物浓度过大时，影响了碱性蛋白酶和蛋白质分子的自由扩散，不利于酶解反应。因此，该试验的最适料液比为1∶5。

2.5 酶与底物的质量比对ACE抑制率的影响 

按“1.3.3.5”所述进行试验，结果如图5所示。当底物和酶质量比为3%时，ACE抑制率达到最大，为82.4%，后再增加酶用量，ACE抑制率的变化不大，原因可能为酶用量增加到一定程度，酶和蛋白质的结合达到饱和状态。当底物和酶质量比为2%，ACE抑制率为82.2%，考虑到酶的价格，故该试验确定最佳底物和酶质量比为2%。

2.6 翡翠贻贝ACE抑制肽酶解工艺条件优化 

由表5中极差R分析得出，4个因素对酶解产物的ACE抑制率影响从大到小依次为pH、温度、酶与底物的质量比、料液比，其中，pH为主要影响因素。最佳酶条件组合为A2B2C1D1，即酶解pH为9.5，酶解温度为50 ℃，料液比为1∶4，酶与底物的质量比为1%。

2.7 水解时间对ACE抑制率的影响

按“1.3.3.7”所述进行试验，结果如图6所示。酶解时间在2 h内，水解率和ACE抑制率均随着而增加，当超过2 h时，两者只是略微变化，因为在酶解过程中，翡翠贻贝蛋白质和碱性蛋白酶不断消耗减少，底物生成增加，都不利于酶解反应。故确定最佳酶解时间为2 h。

3 结论

该研究分别用4种蛋白酶（中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶）酶解翡翠贻贝中的蛋白质制备翡翠贻贝降血压肽，以酶解液的ACE抑制率为指标，选出最佳用酶，通过单因素试验、正交试验研究选出最佳酶解工艺，结果表明，最佳酶解工艺为碱性蛋白酶、料液比为1∶4、酶与底物质量比1%、酶解pH 9.5、酶解温度为50 ℃、酶解时间2 h，此时，ACE抑制率84.34%，水解率为24.67%。此酶解方法简单、可行，可以作为酶解翡翠贻贝的酶解方法，得到高活性的ACE酶抑制剂。

参考文献

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