藏药西伯利亚蓼降尿酸活性部位筛选及HPLC分析

朱继孝 王陆 钟国跃

摘要 [目的]研究藏药西伯利亚蓼不同部位降尿酸活性，并采用HPLC法进行分析检测。[方法]以氧嗪酸钾盐诱导建立小鼠急性高尿酸血症模型，连续灌胃给予西伯利亚蓼水部位（2.0、4.0 g/kg）、30%乙醇部位（2.0、4.0 g/kg）、50%乙醇部位（2.0、4.0 g/kg）、90%乙醇部位（2.0、4.0 g/kg）及别嘌呤醇（AP，0.01 g/kg）7 d，探讨西伯利亚蓼不同部位对急性高尿酸血症血尿酸（UA）、肝脏黄嘌呤氧化酶（XOD）活性及尿酸转运体（mURAT1、mGLUT9 和mOAT1）mRNA表达的影响，并对不同部位进行HPLC分析。[结果]与模型组相比，AP以及30%、50%、90%乙醇部位显著降低高尿酸血症的血尿清水平;50%、90%乙醇部位既可以抑制黄嘌呤氧化酶活性又可以调控尿酸转运体的表达;30%乙醇部位仅对尿酸转运体具有调控作用;不同部位HPLC图显示除了30%、50%乙醇部位化学成分有重叠，西伯利亚蓼不同部位化学成分差别较大。[结论]30%、50%、90%乙醇部位是西伯利亚蓼的降尿酸的活性部位，其作用机制为抑制XOD活性和调控尿酸转运体的表达;西伯利亚蓼不同部位HPLC图有一定的差别，为探讨西伯利亚蓼不同部位降尿酸药效物质基础提供一定的依据。

关键词 西伯利亚蓼;降尿酸;活性部位;筛选;HPLC;作用机制

中图分类号 R282.71  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）10-0141-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.038

Abstract [Objective] The research aimed to study the lowering uric acid activity of different parts of Polygonum sibiricum， and to analyze and detect it by HPLC.[Method]Water fractions （2.0， 4.0 g/kg）， 30% ethanol fractions （2.0， 4.0 g/kg）， 50% ethanol fractions （2.0， 4.0 g/kg）， 90% ethanol fractions （2.0， 4.0 g/kg） and allopurinol （AP， 0.01 g/kg） were administered to hyperuricemia mice induced by potassium oxonate for seven days. The level of uric acid （UA） and xanthine oxidase （XOD） on different fractions were analyzed and the mRNA express of renal protein transporter （mOAT1， mURAT1 and mGLUT9） were also studied. The different parts of P. sibiricum were analyzed by HPLC. [Result]Compared with the model group， AP and 30%， 50%， 90% ethanol fractions of P. sibiricum obviously lowered the serum UA levels; 50% and 90% ethanol fractions not only inhibited the activity of XOD， but also regulated the expression of uric acid transporter; 30% ethanol fractions only regulated the uric acid transporter.The HPLC chart of different parts showed that the chemical constituents of different fractions were obvious distinctions except for the overlap of 30% and 50% ethanol fractions. [Conclusion]30%， 50% and 90% ethanol fractions are effective fractions of P. sibiricum and its mechanism is to inhibit XOD activity and regulate the expression of uric acid transporters. The HPLC images of different parts have certain differences， which provide a basis for exploring the physiochemical discussion for the reduction of uric acid.

Key words Polygonum sibiricum;Lowering uric acid;Active site;Screening;HPLC;Mechanism of action

在普通人群中，痛風患病率在全球范围内为0.1%～10.0%，其中老年人、男性的发病率偏高[1]。现有治疗痛风药物主要有别嘌呤醇、苯溴马隆等[2]，但由于副作用较多，患者难以长期服用和耐受[3]，远远不能满足临床需求。因此，亟需开发高效低毒、作用机制新颖、价格相对低廉的抗痛风药物。

基于“相生相克”的中医理论，国内外学者考虑从传统中药，或是民族药中寻找有效的抗痛风药物。中药包括民族药治疗痛风、高尿酸血症备受关注，取得了一些进展[4]。目前国内外学者已对多种草药单方或复方提取物进行了抗痛风活性研究，如短管兔耳草[5]、三妙丸[6]、丹溪痛风方[7]、栀子[8]、车前草[9]、黄柏[10]、唐古特大黄[11]、茶树根[12]、荬麻藤[13]、猫须草[14]等，其作用机制涉及到降尿酸的生成和促进尿酸排泄2种作用机制。由此可见，从中药甚至民族药中寻找抗痛风药物具有潜在的研究前景。

藏药西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum）是蓼科（Polygonaceae）蓼属植物多年生草本，主要分布于蒙古、俄罗斯、西藏、东北、华北等地，具有疏风清热、利水消肿的功效，目前鲜见西伯利亚蓼的药理研究。王晓云等[15]研究发现西伯利亚蓼 70%乙醇总提取物具有降尿酸作用，但其有效部位尚不清楚。基于此，该研究采用高尿酸血症模型研究西伯利亚蓼不同部位降尿酸作用，并对不同部位进行高效液相分析比较，为西伯利亚蓼的开发及利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物。

110只昆明种小鼠，雄性，SPF级，从湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买，动物许可证号：SCXK（湘）2013-0004，整个试验保持在室温23～25 ℃。

1.1.2 试验仪器。

CP214型电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司;傅日PCR仪，杭州博日科技有限公司;电热恒温箱，上海博迅实业有限公司;UV2100 紫外可见分光光度仪，北京瑞利分析仪器公司;Biorad凝胶成像仪，美国伯乐有限公司;CP214型电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司;旋转蒸发仪，瑞士布奇有限公司;RORMA-86C 型超低温冰箱，美国Thermo公司。

1.1.3 药品及试剂。

氧嗪酸钾盐（批号STBD5759V）和别嘌呤醇（批号081M1112V）由Sigma-Aldrich生产;尿酸测定试剂盒（20150428）、黄嘌呤氧化酶测试盒（20151210）、考马斯亮蓝测试盒（20151208）由南京建成生物工程研究所生产;总RNA 提取试剂盒（批号N3205）由天根生化科技（北京）有限公司提供;反转录试剂盒（批号0000123564）由美国Promega 公司提供;尿酸转运体引物购买于天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 试材。

藏藥西伯利亚蓼于2013年10月采自西藏昌都，经江西中医药大学钟国跃研究员鉴定为Polygonum sibiricum Laxm的干燥全草。藏药西伯利亚蓼药材用70%乙醇提取，过D101大孔树脂不同梯度洗脱得到4个部位：水部位（FW，450.0 g）、30%乙醇部位（F30%，30.0 g）、50%乙醇部位（F50%，45.0 g）、90%乙醇部位（F90%，12.0 g），各部位的提取率分别为15.0%、1.0%、1.5%、0.4%[16]。

1.2 试验方法

1.2.1 小鼠分组、造模及给药。

将110只小鼠随机分为11组，每组10只，分别为空白组（N）、模型组（急性高尿酸血症组，M）、阳性对照组（别嘌呤醇组，AP）、水部位低剂量组（FWL）、水部位高剂量组（FWH）、30%乙醇部位低剂量组（FL30%）、30%乙醇部位高剂量组（FH30%）、50%乙醇部位低剂量组（FL50%）、50%乙醇部位高剂量组（FH50%）、90%乙醇部位低剂量组（FL90%）、90%乙醇部位高剂量组（FH90%）。赵雪梅等[14]研究西伯利亚蓼总提物降尿酸发现，西伯利亚蓼低、中、高剂量组均可显著降尿酸作用，因此该研究西伯利亚蓼给药剂量仍按生药量计算，不同部位低、高剂量组给药剂量分别为2.0、4.0 g/kg，别嘌呤醇给药剂量为0.01 g/kg，每天08：00灌胃给予模型组及各给药组氧嗪酸钾盐 250 mg/kg，1 h后给予药物，连续给药7 d，每天一次，空白组和模型组分别灌入相应体积的生理盐水，给药剂量均为15 mL/kg，第7天给药1.0 h后按照文献[5]取血和分离肝脏、肾脏。

1.2.2 血清尿酸水平（UA）和尿素氮（BUN）测定。按照尿酸和尿素氮试剂盒说明方法测定。

1.2.3 肝脏黄嘌呤氧化酶（XOD）的活性测定。将小鼠肝脏组织称重，按照文献方法[8，14]测定蛋白含量及XOD活性。

1.2.4 肾脏尿酸转运体（mURAT1、mGLUT9和mOAT1）mRNA 的表达。

参考文献[5，15]测定肾脏尿酸转运体 URAT1、OAT1和GLUT9的mRNA表达：取肾脏皮质组织0.1 g，按照试剂盒方法，TRIzol 法提取总 RNA。加入引物序列分别为 URAT1（5′-GCTACCAGAATCG-GCACGCT-3′，5′-CACCGG GAAGTCCACAATCC-3′）、GLUT9（5′-ACTCCTACTGCTTCCTCGTCTT-3′，5′-GCT-GATTTCTGCATGGGTTC-3′）、OAT1（5′-ACGGGAAA-CAAGAAGAGGG-3′，5′- AAGAGAGGTATGGAGGGGTAG-3′）、GAPDH（5′-TGAGGCCGGTGCTGAGTAT GT-3′，5′-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′），按照文献[14]的扩增条件进行扩增。采用琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像仪成像，计算光密度。以 GAP-DH 作为参照计算得到待测基因的相对表达值。

1.2.5 不同部位高效液相色谱分析。

1.2.5.1 西伯利亚蓼供试品溶液制备。准确称取西伯利亚蓼不同部位FW、F30%、F50%、F90%各20 mg，加入甲醇和水不同比例各2.0 mL超声溶解，得到10 mg/mL的供试品溶液。

1.2.5.2 色谱条件。色谱柱为Intersil ODS-SP（4.6 mm×150 mm，5 μm）;甲醇（A）和水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～6 min，A 10%～10%;6～10 min，A 10%～30%;10～30 min，A 30%～60%;30～50 min，A 60%～90%;50～55 min，A 90%～100%;55～60 min，A 100%～10%;60～65 min，A 10%～10%），柱温为30 ℃，流速1.0 mL/min，运行时间为65 min。

1.3 统计学处理

统计学处理采用 SPSS 18.0 软件，数据结果用±S表示。采用单因素方差分析，P<0.05 表明具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 藏药西伯利亚蓼不同部位对高尿酸血症小鼠UA、XOD、BUN活性的影响

由表1可知，与空白组（N组）相比，模型组（M组）小鼠UA、XOD和BUN显著升高（P<0.01，P<0.05）;与M组相比，AP组、FL30%、FH30%、FH50%、FH90%组在一定程度上均可降低高尿酸血症的血尿清水平（P<0.01，P<0.05）。XOD是体内嘌呤类物质代谢成尿酸最后两步的关键酶，通过不同部位对XOD活性影响表明，除了FL30%、FH30%以外，其他部位低、高劑量组均对肝脏XOD具有一定的抑制作用（P<0.01，P<0.05）。BUN是检验肾功能的重要指标，可以反映肾小球滤过和肾小管重吸收的功能，FWL、FWH、FL30%、FH30%、FH90%均可降低高尿酸血症小鼠尿素氮的水平。

2.2 藏药西伯利亚蓼不同部位对肾脏尿酸转运体（mOAT1、mURAT1和mGLUT9）mRNA的表达

由图1可知，与模型组（M组）相比，AP组、FWL、FL30%、FL90%、FH90%对小鼠肾脏URAT1 mRNA的表达具有显著下调作用（P<0.01，P<0.05），其中FWL可下调URAT1 mRNA至正常水平;西伯利亚蓼不同部位低、高剂量组均可显著下调GLUT9 mRNA的表达（P<0.01，P<0.05），其中AP、FH90%可下调URAT1 mRNA至正常水平;仅AP、FWL、FH30%、FL50%、FH50%可显著上调OAT1 mRNA的表达，且AP、FWL、FL50%、FH50%均可上调OAT1 mRNA至正常水平及以上（P<0.01）。

2.3 藏药西伯利亚蓼不同部位HPLC 

由图2可知，除了F30%和F50%化学成分有部分重叠，西伯利亚蓼不同部位化学成分差别较大;王洪玲等[16]研究发现西伯利亚蓼30%、50%乙醇部位都含有芦丁和番石榴苷，此外50%乙醇部位还含有木犀草素和槲皮素。

3 结论与讨论

“黄水病”和“恶性腹水”是藏区多发疾病，也是藏医学临床具有治疗优势的病种之一。基于本草考证和实地调查，发现“曲玛孜”类药材为常用治疗这类疾病的藏药材。西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum）为藏药“曲玛孜”基原品种之一，目前鲜见相关的化学和药理学研究。王晓云等[15]研究发现西伯利亚蓼70%乙醇部位具有降尿酸作用，但是其有效部位和药效物质基础尚不清楚。基于此，该研究对西伯利亚蓼大孔树脂洗脱的4个部位进行降尿酸研究，发现30%、50%、90%乙醇部位具有降尿酸作用;目前研究表明XOD常用于痛风、杀菌及自由基分子损伤等模型研究，西伯利亚蓼水部位（FW）未显示明显的抗尿酸作用，但是对XOD具有一定的抑制作用，提示FW可能具有治疗其他疾病的可能;30%乙醇部位具有降尿酸作用，但是对XOD没有抑制作用，推测30%乙醇部位可能存在其他降尿酸作用机制。

尿酸转运体蛋白是近年来国外学者比较关注的热点[17]，其中URAT1、GLUT9 和OAT1分别负责尿酸的重吸收、分泌和转运作用。该研究发现30%乙醇部位可以显著下调URAT1和GLUT9、上调OAT1 mRNA的表达;50%乙醇部位可显著下调GLUT9和上调OAT1 mRNA的表达;90%乙醇部位可显著下调URAT1和上调OAT1 mRNA的表达，以上研究进一步表明西伯利亚蓼降尿酸存在不同途径。

通过文献查阅，发现黄酮类成分（如芦丁、木犀草素、桑色素等）具有抗痛风活性[18-21]，该研究发现30%和50%乙醇部位均含有黄酮类化合物，推测黄酮化合物可能是这2个部位抗痛风的活性成分。尿素氮是检验肾功能的重要指标，30%、90%乙醇部位均可降低高尿酸血症小鼠尿素氮的水平，提示西伯利亚蓼具有降尿酸的同时也具有改善肾功能的功效。

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