纤维素酶法制备海茸抗氧化多糖的研究

邹鹏飞 杜芬 魏星

摘要 选用纤维素酶法制备海茸抗氧化多糖，并设计应用响应面法优化制备工艺。在单因素试验的基础上，选取pH、温度和料液比为自变量，以羟自由基清除活性及超氧阴离子清除活性为响应指标，确定纤维素酶法制备海茸抗氧化多糖的最佳工艺为料液比1∶40（g∶mL），加酶量2%，pH 5，在50 ℃水浴中搅拌提取2 h。在该试验条件下，超氧阴离子抑制率为（22.28±0.97）%，羟自由基抑制率为（77.64±1.82）%，试验值与预测值相近，说明模型拟合良好，优化工艺准确可行。

关键词 纤维素酶;海茸;抗氧化活性;多糖

中图分类号 R282.77  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）10-0145-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.039

Abstract Cellulasecatalyzed hydrolysis was used to extract antioxidant polysaccharides from Durvillaea antarctica polysaccharides. Respone surface analysis methodology （RSM） was applied to optimize extraction process. Based on singlefactor experiments，pH，extraction temperature and solidliquid ratio were selected as affecting factors for BoxBehnken central composite experiment design，and hydroxyl radical scavenging activity and superoxide anion scavenging activity were taken as response indexes to determine the best process for preparation of antioxidant polysaccharides from Durvillaea antarctica by cellulase method. The process was as follows： the solidliquid ratio was 1∶40 （g∶mL），the cellulase dosage was 2%，the pH was 5，and the mixture was extracted in a water bath at 50 ℃ for 2 h.Under the optimum conditions，the superoxide free radicals scavenging capacity was （22.28±0.97）% and the hydroxyl radical scavenging capacity was （77.64±1.82）%. The experimental values were close to the predicted values，which indicated that the model fit well and the optimization process was accurate and feasible.

Key words Cellulose enzyme;Durvillaea antarctica;Antioxidant activity;Polysaccharides

南極海茸（Durvillaea antarctica）作为一种营养丰富的大型褐藻，主要分布于南极洲附近及智利南部。极端的生存环境使其富含多种生物活性物质，其中南极海茸富含褐藻胶、岩藻糖、葡聚糖等多种具有生物活性的多糖[1]，研究表明南极海茸多糖具有免疫调节活性、抗凝血活性、降血糖及抗氧化活性等作用[2-5]。

多糖的抗氧化活性的作用机理目前研究尚不明确，但可以肯定的是多糖的抗氧化活性与其结构有关，因此改变多糖的组成，使其暴露更多的活性基团，从而可以提高多糖的抗氧化活性[6-9]。目前多糖降解的方法主要有物理法、化学法、酶降解法等，其中酶法降解反应条件温和，易于操作[10-13]。酶按作用机制分为专一性酶和非专一性酶，其中非专一性酶价格低廉，商业化程度更高。已有文献报道纤维素酶可以对多种多糖有明显的降解作用，其反应过程受酶添加量、pH、反应时间、反应温度及料液比等因素的影响[14-15]。目前国内对南极海茸的研究较少，尤其是活性多糖方面就更为少见。在国内已有研究中，对南极海茸的研究主要偏重于饮食方面[16]，在南极海茸多糖方面主要集中在提取纯化[17]、光谱结构分析及单糖组成[18]等，南极海茸多糖的生物活性方面研究较少。笔者将纤维素酶应用于制备海茸抗氧化多糖，并对南极海茸抗氧化多糖的制备工艺进行优化，为南极海茸多糖的研究及其在食品行业、化妆品行业等多领域的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试材

海茸粗多糖，由青岛海洋生物医药研究院功能制品平台提供;羟自由基测试试剂盒、超氧阴离子自由基测试试剂盒，南京建成生物工程研究所;纤维素酶，和氏璧生物技术有限公司;其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器

紫外可见光分光光度计，UNICO公司;SY21-NI4V恒温水浴锅，北京长风仪器仪表公司;冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 海茸多糖抗氧化活性测定。

1.3.1.1 超氧阴离子自由基清除率的测定[19]。清除超氧阴离子自由基的能力采用邻苯三酚自氧化法，邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化，生成有色中间产物和超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基对自氧化有催化作用。选择超氧阴离子自由基测试试剂盒进行检测，以蒸馏水代替样品做空白组，按下式计算清除率：

超氧阴离子清除率=A空白-A样品A空白×100%

式中，A样品、A空白分别为样品和空白在520 nm 处的吸光度。

1.3.1.2 羟自由基清除率的检测[20]。Fenton反应是常见的产生羟自由基的化学反应，H2O2的量和Fenton反应生成的羟自由基的量成正比，当给予电子受体后，通过显色反应即可确定羟自由基清除率。羟自由基清除能力的测定是通过羟自由基测试试剂盒进行检测，在 520 nm 处测定吸收度。空白组以蒸馏水代替供试样品，并按下式计算清除率：

羟自由基清除率=A样品-A空白A对照-A空白

式中，A样品、A空白、A对照分别为样品、空白和对照的吸光度。

1.3.2 酶解条件的选择。纤维素酶法制备海茸抗氧化多糖其中以纤维素酶添加量、pH、温度、时间及料液比为单因素，分别以羟自由基清除活性及超氧阴离子自由基清除活性为考察指标确定酶解条件。

1.3.3 酶解条件的响应面优化。根据单因素试验结果，选择pH、温度、料液比3个因素为自变量，以羟自由基清除活性、超氧阴离子清除活性为响应值，采用Design-Expert 8.05 软件设计响应面试验方案。

1.4 数据分析

试验重复 3 次进行，采用 Design-Expert 8.05 软件进行响应面试验的设计和分析，采用 SPSS 17.0 软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 海茸多糖的羟自由基清除活力的单因素试验

以羟自由基清除活性为指标，根据纤维素酶法制备海茸抗氧化多糖单因素试验设计进行，结果如图1所示。从图1可以看出，该酶在pH 4.5的酶解产物显示出最优的羟自由基清除活性;该酶在40～60 ℃均具有较高的酶活力，且在45 ℃达到最高;反应时间不同，海茸多糖的聚合度不同，其羟自由基清除活性不同，反应时间2 h时，酶解产物显示出较高的羟自由基活性，综合考虑时间成本，选择2 h进行后续响应面分析;当料液比为1∶40时酶解产物羟自由基活性达到最大。当酶添加量低于3%时，随着酶浓度的增加酶解产物羟自由基活性随之增加，且当酶添加量高于1.5%增速变缓。

2.2 海茸多糖的超氧阴离子自由基清除活力的单因素试验 

以超氧阴离子清除活性为指标，根据纤维素酶法制备海茸抗氧化多糖单因素试验设计进行，结果如图2所示。从图2可以看出，pH 4～5时酶解产物显示较高的超氧阴离子清除活性;酶解产物在温度45 ℃时超氧阴离子清除活性略高于其他温度的酶解产物，但温度优势不明显;酶解产物在2 h及料液比1∶40时，超氧阴离子清除活性达到最大;酶解产物的超氧阴离子清除活性与酶添加量整体呈现正相关关系。

2.3 响应面法对纤维素酶解条件的优化

在单因素试验的基础上，综合考虑酶解产物的羟自由清除活性及超氧阴离子清除活性，采用Design-Expert 8.05进行3因素5水平设计响应面试验，固定酶解时间2 h，纤维素酶添加量2%，以pH（A）、溫度（B）和料液比（C）为自变量，以超氧阴离子抑制率及羟自由基抑制率为响应值，进行响应面法分析纤维素酶解条件优化，结果如表1所示。

对超氧阴离子清除活性与温度、pH和料液比进行方差分析，结果发现该数学模型F值为4.42（P=0.031 4<0.05），达到了显著水平，说明该方程的试验点与结果相吻合;而失拟性检验F值为2.91（P=0.164 2>0.05），差异不显著，表明方程没有失拟因素，回归方程的拟合较好，模型能够反映真实的情况。采用Design-Expert 8.05统计分析软件进行回归优化得到模型为：

超氧阴离子活性=22.95-0.67A-0.37B+0.62C+1.33AB-1.81AC+0.66BC-1.75A2-0.92B2-2.52C2。

方差分析表明，3个因素对酶解产物超氧阴离子清除活性的影响从大到小依次为pH、料液比、温度，综上所述该回归方程可以用于描述酶解产物超氧阴离子清除活性与酶解因素的关系。

对羟自由基清除活性与温度、pH和料液比进行方差分析，结果发现该数学模型F值为6.55（P=0.010 8<0.05），达到了极显著水平，说明该方程的试验点与结果相吻合;而失拟性检验F值为3.68（P=0.120 0>0.05），差异不显著，表明方程没有失拟因素，回归方程的拟合较好，模型能够反映真实的情况。采用Design-Expert 8.05统计分析软件进行回归优化得到模型为：

羟自由基清除活性=87.80-4.01A+3.06B+1.81C-2.65AB-2.80AC+4.54BC-8.06A2-1.68B2-480C2。

方差分析表明，3个因素对酶解产物羟自由基清除活性的影响从大到小依次为pH、温度、料液比，综上所述该回归方程可以用于描述羟自由基清除活性与酶解因素的关系。

2.4 最佳酶解条件的确定与验证 

综合考虑超氧阴离子和羟自由基清除活性最大值进行条件优选，得出最优方法为料液比1∶40，加酶量2%，pH 5，在50 ℃水浴中搅拌提取2 h，得到活性最高的多糖提取物，其抗超氧阴离子抑制率为2272%，羟自由基抑制率为78.71%。采用优选出来的最佳条件进行试验验证，超氧阴离子抑制率为22.28%±0.97%，羟自由基抑制率为77.64%±1.82%，得到的实际试验与理论值相差较小，因此Box-Behnken Design-响应面优化试验可行，模型设计合理。

3 结论

在单因素试验的基础上，采用Design-Expert 8.05进行3因素5水平响应面分析，得到纤维素酶解海茸多糖的回归方程模型，方程拟合较好。在所选的各因素水平范围内，pH对酶解工艺的影响最大，温度及料液比对酶解产物羟自由基清除活性、超氧阴离子清除活性的影响顺序不同，综合考虑2种离子的清除活性得到最优条件为料液比1∶40、加酶量2%、pH 5，在50 ℃水浴中搅拌提取2 h，以该条件制备的海茸多糖具有较好的抗氧化活性，为其进一步在食品领域、化妆品领域提供更好的应用前景。

参考文献

[1] 李建杰，胡婷，李全才，等.南极海茸多糖咀嚼片的制备及含量测定[J].中国海洋药物，2019，38（1）：56-62.

[2] OHISHI H，HATTORI T，TANI H，et al.Seaweedderived immunostimulant and anti inflammotory agent：WO 2008/059819 A1[P].2008-05-22.

[3] MATSUHIRO B，ZUGA E，JASHES M，et al.Sulfated polysaccharides from Durvillaea antarctica[J].Hydrobiologia，1996，321（1）：77-81.

[4] SHARIFUDDIN Y，CHIN Y X，LIM P E，et al.Potential bioactive compounds from seaweed for，diabetes management[J].Marine drugs，2015，13（8）：5447-5491.

[5] HENTATI F，DELATTRE C，URSU A V，et al.Structural characterization and antioxidant activity of watersoluble polysaccharides from the Tunisian brown seaweed Cystoseira compressa[J].Carbohydrate polymers，2018，198：589-600.

[6] 冉靓，楊小生，王伯初，等.抗氧化多糖的研究进展[J].时珍国医国药，2006，17（4）：494-496.

[7] 马军，侯萍，陈燕，等.几种海藻多糖抗氧化活性及体外抗脂质过氧化作用的研究[J].南方水产科学，2017，13（6）：97-104.

[8] CHEN S G，HU Y Q，YE X Q，et al.Sequence determination and anticoagulant and antithrombotic activities of a novel sulfated fucan isolated from the sea cucumber Isostichopus badionotus[J].Biochimica et biophysica acta，2012，1820（7）：989-1000.

[9] YU L，XUE C H，CHANG Y G，et al.Structure and rheological characteristics of fucoidan from sea cucumber Apostichopus japonicus[J].Food chemistry，2015，180：71-76.

[10] 李萍，李卫燕，曹蔚.酶解技术在多糖结构和活性研究中的应用进展[J].西北药学杂志，2015，30（4）：433-436.

[11] MENG J，LV Z Y，QIAO X H，et al.The decay of Redoxstress Response Capacity is a substantive characteristic of aging：Revising the redox theory of aging[J].Redox biology，2017，11：365-374.

[12] LAHRSEN E，LIEWERT I，ALBAN S.Gradual degradation of fucoidan from Fucus vesiculosus and its effect on structure，antioxidant and antiproliferative activities[J].Carbohydrate polymers，2018，192：208-216.

[13] 李冬霞，夏文水.脂肪酶中具有壳聚糖酶活力组分的作用模式及鉴定[J].食品工业科技，2008，29（8）：115-116，120.

[14] 孙丽娜，范英兵，胡冬慧，等.响应面优化纤维素酶提取蓝莓多糖工艺研究[J].食品研究与开发，2017，38（23）：57-60.

[15] 王鹏，郭丽，孔璐，等.碱浸提和纤维素酶辅助提取蓝莓多糖及其抗氧化能力的对比研究[J].粮食与油脂，2017，30（4）：94-97.

[16] 丛大鹏.南极海茸（Durvillaea antarctica）多糖提取、衍生物制备及免疫活性研究[D].青岛：中国海洋大学，2015.

[17] 蔡如繁.南极海茸营养成分及多糖提取、分离纯化、抗氧化性和结构特性研究[D].杭州：浙江工业大学，2014.

[18] 何晋浙，蔡如繁，孙培龙.南极海茸多糖结构及其单糖组分的分析[J].食品与发酵工业，2014，40（3）：196-200.

[19] 范三红，任嘉兴，张锦华，等.响应面优化羊肚菌多糖提取工艺及抗氧化性[J].食品工业科技，2019，40（6）：179-185，192.

[20] 黄上峰，陆飞燕，黄元河，等.三七多糖抗氧化活性研究[J].微量元素与健康研究，2018，35（1）：30-32.