脱毒菜籽多肽对小鼠免疫功能的影响

黄姗芬，李云亮，杨 雪，王禹程，马海乐

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013)



脱毒菜籽多肽对小鼠免疫功能的影响

黄姗芬，李云亮，杨 雪，王禹程，马海乐*

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013)

[目的]研究脱毒菜籽多肽对小鼠免疫功能的影响。[方法]试验组以低、中、高剂量组0.334、0.667和2.000 g/(kg·d)的脱毒菜籽多肽灌胃小鼠，对照组以等体积纯净水灌胃，30 d后进行二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应试验、ConA 诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验、抗体生成细胞检测和血清溶血素测定试验、小鼠碳廓清试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、NK细胞活性测定试验、试验前后小鼠体重以及脏器/体重比值试验。[结果]脱毒菜籽多肽对小鼠的耳廓肿胀、脾淋巴细胞转化、吞噬指数a和NK细胞活性均有显著影响，但对小鼠体重增长、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、脾抗体生成细胞量、血清溶血素水平和腹腔巨噬细胞吞噬能力均无影响。[结论]脱毒菜籽多肽具有增强免疫力的功能。

脱毒菜籽；多肽；鼠；免疫功能；影响

我国的油菜籽资源丰富，产量位居世界第一，油菜籽年产量高达1 300万t以上。菜籽粕是油菜籽经榨油后剩下的副产物，菜籽粕中蛋白含量高达35%～45%[1]，氨基酸含量丰富且组成较均衡，营养价值较高，但菜籽粕中含有大量的硫苷、芥酸等有毒有害物质，极大地限制其利用程度。目前大多先对菜籽粕进行脱毒处理[2]，经脱毒后的菜籽粕，无论是生物效价还是利用率均很高，是一种非常优质的植物蛋白资源。近年来，为促进脱毒菜籽蛋白高值化利用，采用酶解法制备菜籽功能性多肽已成为研究热点问题之一[3-6]。大量研究表明，菜籽多肽具有降血压[7-11]、抗氧化[12-16]、抗肿瘤[17-18]、提高免疫力[19]等功效。

免疫力是人体的防御机制，是人体抵抗外来疾病的关卡。人体通过免疫系统识别自身和异己物质，并破坏和排斥异己的物质，以维持健康。人体免疫力低下，容易感染细菌、病毒和真菌，导致患病。免疫力低下的症状通常不易被人们察觉，但它却会严重威胁人体健康。目前对于菜籽多肽增强免疫功能的研究较少[20]，且大多数文献关于菜籽多肽对免疫功能影响的研究不透彻[18，21]。笔者以脱毒菜籽多肽灌胃小鼠，研究试验前后动物体重、脏器/体重比值、细胞免疫功能、体液免疫功能、非特异性免疫，探索菜籽多肽对小鼠免疫功能的影响，为菜籽多肽高值化应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品与试剂。脱毒菜籽多肽购自江苏天琦生物科技有限公司，多肽含量≥85%。小牛血清、刀豆蛋白A(ConA)、四氮唑蓝(MTT)、2-硫基乙醇(2-ME)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)均购自Sigma试剂公司。绵羊红细胞(SRBC)购自北京百奥莱博科技有限公司。RPMI1640细胞培养基购自上海浩然生物技术有限公司。

1.1.2 主要仪器设备。MSS全波长酶标仪，美国热电·芬兰雷勃(Thermo Labsystems Co)；SPX-250B生化培养箱，常州国华电器有限公司。

1.1.3 试验动物及设施。选用上海斯莱克实验动物有限公司提供的18.0～22.0 g健康雌性清洁级ICR小鼠[动物生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002号]。全部动物均给予灭菌鼠饲料和灭菌水自由取用。

1.2 试验方法

1.2.1 受试物和脱毒菜籽多肽剂量设计。

1.2.1.1 动物分组试验。分批按体重随机分为4组试验：①二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应试验；②抗体生成细胞检测和血清溶血素测定试验；③小鼠碳廓清试验；④小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。

1.2.1.2 剂量设计。成人(按60 kg体重计)每日推荐摄入量为4 g，相当于0.066 7 g/(kg·d)。试验按低、中、高设置0.334、0.667和2.000 g/(kg·d)3个剂量组，分别相当于人体推荐量的5、10和30倍。溶剂对照组以等体积纯净水灌胃。

1.2.1.3 受试物的前处理。称取样品3.34、6.67和20.00 g，分别加纯净水至200 mL配制成各组受试液(存放于4 ℃冰箱，每2 d配制1次)。各组小鼠以0.02 g/(kg·d)的灌胃容积，连续经口灌胃30 d后测其各项免疫指标。

1.2.2 体重及脏器指数试验。

1.2.2.1 体重测定。称量受试物经灌胃脱毒菜籽多肽前后的体重。

1.2.2.2 脏器指数。参照白玉[22]的方法检测受试物的脏器/体重比值(胸腺指数和脾指数)。

1.2.3 细胞免疫功能试验。

1.2.3.1 二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应。参照葛飞等[23]的方法略有改动。采用1% DNFB丙酮麻油溶液涂抹受试物耳廓，使其致敏。

1.2.3.2 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验。采用MTT测定法[22]，略有改动。用于显色测定受试物脾淋巴细胞的增殖数量。

1.2.4 体液免疫功能试验。

1.2.4.1 抗体生成细胞检测。采用Jerne改良载片测定法[24]。通过对小鼠腹腔注射SRBC，刺激其脾细胞产生SRBC抗体，将该脾细胞与SRBC进行溶血空斑试验，并计算溶血空斑数。

1.2.4.2 血清溶血素测定。采用半数溶血值(HC50)测定法[23]，略有改动，其中以SA缓冲液代替血清设为对照。通过对小鼠腹腔注射SRBC，使其血清产生SRBC抗体，其血清与SRBC发生溶血反应，并释放血红蛋白，检测其半数溶血时的光密度值。

1.2.5 非特异性免疫功能试验。

1.2.5.1 小鼠碳廓清试验。参照白玉[22]的方法略有改动，其中印度墨汁∶生理盐水调整为1∶7(V/V)。在一定浓度范围内，体内碳颗粒被清除的速率与血碳浓度呈指数函数关系。从小鼠尾静脉注射墨汁，2和10 min后分别测其血液的光密度值。

1.2.5.2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。采用滴片法[24]。通过对小鼠腹腔注射SRBC，激活巨噬细胞，取出该细胞后与鸡红细胞反应，经染色后用显微镜观察平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数。

1.2.5.3 NK细胞活性测定。参照白玉[22]的方法略有改动。其中靶细胞最大释放孔加2.5% Triton。通过脾细胞悬液与靶细胞反应，释放乳酸脱氢酶，发生显色反应，检测其光密度值。

2 结果与分析

2.1 脱毒菜籽多肽对小鼠体重的影响(表1) 5组免疫试验结束后，各剂量组小鼠体重均有所增长，但小鼠体重的增长均与溶剂对照组相比无显著差异(P>0.05)，表明低、中、高剂量脱毒菜籽多肽对小鼠体重的增长无明显作用。

表1 脱毒菜籽多肽对每组免疫试验前后小鼠体重的影响

2.2 脱毒菜籽多肽对小鼠脏器/体重比值的影响(表2) 各剂量组小鼠与溶剂对照组相比无显著差异(P>0.05)，表明低、中、高剂量脱毒菜籽多肽对小鼠的机体免疫器官的增重无明显作用。

2.3 脱毒菜籽多肽对小鼠耳廓迟发性变态反应的影响 迟发型超敏反应是以单个核细胞浸润和组织细胞损伤为主要特征的细胞免疫反应[25]。由表3可见，各剂量组小鼠耳廓肿胀程度均高于溶剂对照组，且低、中、高剂量组小鼠耳廓肿胀程度与溶剂对照组相比均有显著差异(P<0.01，P<0.05)，表明低、中、高剂量脱毒菜籽多肽对小鼠细胞免疫具有增强作用。

2.4 脱毒菜籽多肽对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响 从表4可看出，各剂量组光密度差值均高于溶剂对照组，仅低剂量组小鼠光密度差值与溶剂对照组相比有显著差异(P<0.01)，表明低剂量脱毒菜籽多肽对小鼠脾淋巴细胞具有增殖作用。

表2 脱毒菜籽多肽对小鼠脏器/体重比值的影响

Table 2 Effect of detoxified rapeseed peptides on viscera/body weight ratio of mouse

组别Group动物数Numberofanimals∥只脾脏/体重比值Spleen/bodyweightratio胸腺/体重比值Thymus/bodyweightratio对照组CK1040.86±7.9921.47±6.84低剂量组Lowdosegroup1039.28±5.1920.15±2.95中剂量组Mediumdosegroup1041.35±8.4220.65±2.99高剂量组Highdosegroup1039.08±6.4122.93±4.57

表3 脱毒菜籽多肽对小鼠耳廓迟发性变态反应的影响

Table 3 Effect of detoxified rapeseed peptides onpinna delayed hypersensitivity of mouse

组别Group动物数Numberofanimals∥只肿胀度Swellingdegreemg对照组CK1014.84±5.88低剂量组Lowdosegroup1023.41±4.98**中剂量组Mediumdosegroup1019.57±3.63*高剂量组Highdosegroup1019.68±5.61*

注：*、**分别表示与对照组相比差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)。

Note：*，* * showed significant differences(P< 0.05)and extremely significant differences(P< 0.01)compared with control group，respectively.

表4 脱毒菜籽多肽对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响

Table 4 Effect of detoxified rapeseed peptides on spleen lymphocyte blastogenesis of mouse

组别Group动物数Numberofanimals只光密度值Opticaldensityvalue-ConA+ConA光密度差Opticaldensitydifference对照组CK100.177±0.0270.457±0.1160.280±0.107低剂量组Lowdosegroup100.202±0.0220.630±0.1090.428±0.100**中剂量组Mediumdosegroup100.187±0.0260.532±0.0910.345±0.086高剂量组Highdosegroup100.196±0.0200.545±0.1190.349±0.109

注：**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

Note：** showed extremely significant differences(P< 0.01)compared with control group.

2.5 脱毒菜籽多肽对小鼠脾抗体生成细胞量的影响 成熟的B细胞定居于脾脏，B细胞在抗原刺激下分化为浆细胞，浆细胞合成和分泌抗体，主要执行机体的体液免疫。由表5可见，各剂量组小鼠的溶血空斑数均高于溶剂对照组，但与对照组相比均无显著差异(P>0.05)，表明脱毒菜籽多肽对小鼠的体液免疫(抗原直接作用B细胞产生抗体)无促进作用。

表5 脱毒菜籽多肽对小鼠脾抗体生成细胞量的影响

Table 5 Effect of detoxified rapeseed peptides on cells production of antibody of mouse spleen

组别Group动物数Numberofanimals∥只空斑数∥×106脾细胞Plaquenumber∥×106Spleencells对照组CK10423.9±97.8低剂量组Lowdosegroup10498.7±152.3中剂量组Mediumdosegroup10476.3±157.4高剂量组Highdosegroup10496.9±131.2

2.6 脱毒菜籽多肽对小鼠血清溶血素水平的影响 SRBC刺激T细胞的活化增殖，在T细胞的辅助下，B细胞活化分泌抗体[26]。从表6可看出，各剂量组小鼠血清半数溶血值(HC50)与溶剂对照组相比，均无显著差异(P>0.05)。表明脱毒菜籽多肽对小鼠的体液免疫(抗原作用T细胞，刺激B细胞间接产生抗体)无促进作用。

表6 脱毒菜籽多肽对小鼠血清溶血素水平的影响

Table 6 Effect of detoxified rapeseed peptides on serum hemolysin level of mouse

组别Group动物数Numberofanimals∥只HC50对照组CK10165.63±6.06低剂量组Lowdosegroup10167.91±1.89中剂量组Mediumdosegroup10168.02±1.26高剂量组Highdosegroup10166.96±2.09

2.7 脱毒菜籽多肽对小鼠碳廓清的影响 表7显示，各剂量组小鼠吞噬指数a均高于溶剂对照组，低、中剂量组小鼠的吞噬指数a与溶剂对照组相比有显著差异(P<0.01，P<0.05)。表明低、中剂量脱毒菜籽多肽对血液中的非特异性免疫具有促进作用。

表7 脱毒菜籽多肽对小鼠碳廓清的影响

Table 7 Effect of detoxified rapeseed peptides on carbon clearance of mouse

组别Group动物数Numberofanimals∥只吞噬速率(K值)Phagocyticrate吞噬指数aPhagocyticindexa对照组CK100.0376±0.01245.983±0.612低剂量组Lowdosegroup100.0485±0.01046.830±0.620**中剂量组Medi-umdosegroup100.0331±0.00656.567±0.514*高剂量组Highdosegroup100.0454±0.00796.326±0.527

注：*、**分别表示与对照组相比差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)。

Note：*，** showed significant differences(P< 0.05)and extremely significant differences(P< 0.01)compared with control group，respectively.

2.8 脱毒菜籽多肽对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响 从表8可以看出，各剂量组小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数均高于溶剂对照组，但与溶剂对照组相比均无显著差异(P>0.05)。表明脱毒菜籽多肽对组织液中的非特异性免疫无明显促进作用。

表8 脱毒菜籽多肽对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响

Table 8 Effect of detoxified rapeseed peptides on the function peritoneal macrophage phagocytosis of mouse

组别Group动物数Numberofanimals∥只吞噬率Phagocyticrate∥%吞噬指数Phagocyticindex对照组CK1014.0±3.00.184±0.032低剂量组Lowdosegroup1014.5±2.70.185±0.040中剂量组Mediumdosegroup1015.4±2.70.207±0.044高剂量组Highdosegroup1015.8±2.40.204±0.044

2.9 脱毒菜籽多肽对小鼠NK细胞活性的影响 从表9可看出，低剂量组小鼠NK细胞活性最高，且与溶剂对照组有显著差异(P<0.05)，表明低剂量脱毒菜籽多肽对NK细胞的杀伤活性有促进作用。

表9 脱毒菜籽多肽对小鼠NK细胞活性的影响

Table 9 Effect of detoxified rapeseed peptides on NK cell activity of mouse

组别Group动物数Numberofanimals∥只NK细胞活性NKcellactivity%对照组CK1040.2±5.5低剂量组Lowdosegroup1051.7±13.1*中剂量组Mediumdosegroup1038.5±9.7高剂量组Highdosegroup1041.2±9.9

注：*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)。

Note：*showed significant differences(P< 0.05)compared with control group.

3 小结

该研究以脱毒菜籽多肽灌胃小鼠，通过对试验前后动物体重、脏器/体重比值、细胞免疫功能、体液免疫功能、非特异性免疫的研究，探索菜籽多肽对小鼠免疫功能的影响。结果表明，经口给予0.334、0.667和2.000 g/(kg·d)菜籽多肽，灌胃30 d后，各剂量组菜籽多肽对小鼠体重增长、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、抗体生成细胞数量、血清溶血素水平均无影响，但能显著提高小鼠脾淋巴细胞的转化效率、耳廓肿胀程度、单核-巨噬细胞功能和NK细胞活性。根据保健食品增强免疫力功能评价标准，菜籽多肽能有效增强小鼠细胞免疫力。

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Effect of Detoxified Rapeseed Peptides on Mouse Immune Function

HUANG Shan-fen, LI Yun-liang, YANG Xue, MA Hai-le*et al

(School of Food and Biology Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang,Jiangsu 212013)

[Objective] The research aimed to study the effect of detoxified rapeseed peptides on immune function. [Method]Low-, medium- and high-dosage group were fed with 0.334, 0.667 and 2.000 g/(kg·d)detoxified rapeseed peptides, respectively, equal volume of pure water as control group. 30 days later, the following experiments were conducted: DNFB induced mouse delayed type hypersensitivity,mouse spleen lymphocyte transformation capacity induced by ConA,antibody forming spleen cells,serum hemolysin,mouse carbon clearance ability,mouse peritoneal macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes,NK cell activity,initial and terminal body weight of mice,viscera/body weight ratio.[Result]The detoxified rapeseed peptides on mouse carbon clearance ability, spleen lymphocyte transformation capacity, phagocytic index a and NK cell activity had significant impact. However rapeseed peptides had no significant effect on mouse weight gain, the thymus/body weight ratio, spleen/body weight ratio,cells production of spleen antibody, serum hemolysin leveland function of peritoneal macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes.[Conclusion]The detoxified rapeseed peptides have effect on enhancing immunity.

Detoxified rapeseed; Peptides; Mouse; Immune function; Effect

国家863计划项目(2013AA102203)；江苏大学高级人才科研启动基金项目(16JDG049)。

黄姗芬(1992-)，女，湖南郴州人，研究方向：多肽提取及功能评价。*通讯作者，教授，博士，博士生导师，从事功能食品、食品物理学加工方法及装备的开发研究。

2016-08-31

S 565.4

A

0517-6611(2016)31-0126-03