烟草bZIP转录因子BZI-4的生物信息分析

李炳泽，王德勋，徐成龙，苏家恩*

(1.大理州烟草公司鹤庆县分公司，云南鹤庆 672100；2.云南省烟草公司大理州公司，云南大理 671000：3.大理州烟草公司祥云县分公司，云南祥云 672100)



烟草bZIP转录因子BZI-4的生物信息分析

李炳泽1，王德勋2，徐成龙3，苏家恩2*

(1.大理州烟草公司鹤庆县分公司，云南鹤庆 672100；2.云南省烟草公司大理州公司，云南大理 671000：3.大理州烟草公司祥云县分公司，云南祥云 672100)

[目的]探讨烟草在采收前的生理期和烘烤过程中的变黄阶段抗逆机制。[方法]利用生物信息学方法对烟草bZIP转录因子BZI-4的理化特性、信号肽、跨膜、系统进化和亚细胞定位进行分析。[结果]烟草bZIP转录因子BZI-4为碱性、水溶性、耐高温和非分泌型的游离蛋白，该蛋白为叶绿体中的转运肽，仅剪切修复后才具有活性，对环境适应能力强。[结论]通过烟草bZIP转录因子BZI-4研究，为烟草抗逆境胁迫研究提供理论基础。

生物信息；转录因子；bZIP；烟草

烟草是我国重要的经济作物，种植面积达100多万hm2，年产量200多万t[1]。受生育期生态条件的影响，不同年份烟草在大田中的生长发育、烤后烟叶产量和品质存在差异。烟草具有可塑造性强、适应性广等特性[2]，在逆境胁迫中，烟草bZIP转录因子BZI-4在植物生长发育、质的形成和量的积累中担当重要角色，主要通过改善细胞的通透性、调节氧化酶和还原酶的活性和防止核酸类物质降解，进而增加烟草的适应性，保证"两烟"品质的稳定[3]。bZIP转录因子是含有一个二聚体结构域的亮氨酸拉链和核酸链的结构域组成的pH>7的亮氨酸拉链蛋白[4]。bZIP转录因子普遍存在于植物中，尤其在烟草中含有4类ZIP转录因子，分别为BZI-1、BZI-2、BZI-3、BZI-4[5-6]。bZIP转录因子BZI-4能够参与烟草植株对病毒和菌害的抵抗、烟草的光信号和外界各种环境的逆境胁迫。笔者研究烟草bZIP转录因子BZI-4在逆境条件下的作用机理，以期为烟草抗逆机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 通过NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得烟草bZIP转录因子BZI-4核酸序列、蛋白序列和编码序列，其登录号分别为AY045572、AAK92215和AY045572。

1.2 方法

1.2.1 烟草bZIP转录因子BZI-4的理化特性分析。通过ExPASy的Compute pI/Mw(http：//web.expasy.org/compute_pi/)在线工具获得烟草bZIP转录因子BZI-4的氨基酸组成、原子总数、总平均亲水性、理论等电点、分子式、脂肪指数、正/负电荷残基总数、不稳定指数、分子质量和氨基酸数[7]。

1.2.2 烟草bZIP转录因子BZI-4的信号肽和跨膜分析。利用MITOPROT(https：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)对烟草bZIP转录因子BZI-4的信号肽进行预测[8]；利用TMpred的统计分析方法，通过TMpred(http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)的多序列比对方法进行跨膜区域的预测，最小值的参数为17，最大值的参数为33。

1.2.3 烟草bZIP转录因子BZI-4的亚细胞定位。采用TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/SubLoc)[9]，其Organism group选Plant，Prediction scope采用Perform cleavage site predictions，Cutoffs选用specificity >0.90(predefined set of cutoffs that yielded this specificity on the TargetP test sets)，通过以上参数对烟草bZIP转录因子BZI-4进行亚细胞定位。

1.2.4 烟草bZIP转录因子BZI-4的系统进化分析。利用烟草bZIP转录因子在NCBI中BLAST，获得菜豆(Phasedusvulgaris)、碧桃(Prunuspersica)、玉米(Zeamays)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)和大豆(Glycinemax)相应bZIP转录因子的氨基酸序列，其登录号分别为AAK25822、AEL13842、NP_001140593、NP_181594、NP_176108和NP_001235209。通过ClustalW 2对多序列进行比对[10]，获得比对文件，并以Clustal的格式储存。采用PhyML 3.0在线工具，对多序列文件构建进化树，其参数Statistical tests for branch support采用Approximate Likelihood-Ratio Test(aLRT)，Number of substitution rate categories的参数为4，Gamma distribution parameter选择estimated参数为1，Proportion of invariable sites选择estimated参数为0，Transition / transversion ratio(nucleic acids only)选择estimated参数为1，获得进化树文件。运用TreeDyn工具对进化树进行查看和编辑[11]。

2 结果与分析

2.1 烟草bZIP转录因子BZI-4的理化特性 通过在线工具分析bZIP转录因子BZI-4的理化特性，结果表明，bZIP转录因子BZI-4因子的原子总数为2 208 Da，总平均亲水性为-0.678，理论等电点为9.76，分子式为C667H1118N206O210S7，脂肪指数为82.10，正/负电荷残基总数分别为17和24，不稳定指数为59.54，分子质量为15 607.8，氨基酸数为138，含量最多的3种氨基酸分别为丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)。表明烟草bZIP转录因子BZI-4为碱性水溶性蛋白；因不稳定指数>40，该转录因子为相对稳定的高耐热性蛋白；因负电荷残基总数少，转录因子为带正电的蛋白。综合分析，烟草bZIP转录因子BZI-4对烟叶水分含量敏感，且在逆境条件下不易损伤。因此，该转录因子能够在烘烤过程中的变黄阶段发挥作用。

2.2 烟草bZIP转录因子BZI-4的信号肽和跨膜分析 由图1可知，信号肽的分值(S score)、剪切位点的分值(C score)和综合剪切位点的分值(Y score)有不同程度的波动，但均小于0.5，因此该转录因子不具有信号肽，不属于分泌蛋白，说明烟草bZIP转录因子BZI-4存在于特定的亚细胞部位发挥作用。由图2可知，烟草bZIP转录因子BZI-4各阶段的TMpred信号均小于500，因此该转录因子不具有跨膜结构，为游离蛋白。这表明烟草在受到生理期或烘烤过程中逆境胁迫时，bZIP转录因子BZI-4能快速激活或抑制下一阶段的反应，表现出抗性作用。

2.3 烟草bZIP转录因子BZI-4的亚细胞定位 由表2可知，BZI-4的序列长为138，其中所占概率最大的叶绿体转运肽概率(cTP)为0.662，线粒体导肽概率(mTP)为0.139，其他类型的分值概率为0.349，这表明烟草bZIP转录因子BZI-4可能为存在于叶绿体中的转运肽，不利于叶绿体在调制过程变黄阶段的降解。对烟草bZIP转录因子BZI-4的剪切位点进行预测，结果显示，在烟草bZIP转录因子BZI-4的第39位存在剪切位点，表明该转录因子属于修饰蛋白，烟草bZIP转录因子BZI-4在未修饰前，以稳定的结构存在于叶绿体中，当外界条件发生变化时，烟草为快速适应环境，通过剪切已存在烟草bZIP转录因子BZI-4的1～39位残基氨基酸，使其活性位点暴露，致使bZIP转录因子在叶绿体中产生活性，从而在采前生理期及烤中变黄期等逆境条件下快速发挥抗逆作用。

图1 bZIP转录因子BZI-4的信号肽预测Fig.1 Signal peptide prediction of bZIP transcription factor BZI-4

注：i为膜内，o为膜外。Note：i was in the membrane，and o was outside the membrane.图2 bZIP转录因子BZI-4的跨膜结构预测Fig.2 Prediction of transmembrane structure of bZIP transcription factor BZI-4

2.4 烟草bZIP转录因子BZI-4的系统进化分析 以菜豆、碧桃、玉米、拟南芥和大豆bZIP转录因子为参考对象，使用Clustalx2和PhyML 3.0对菜豆、碧桃、玉米、拟南芥和大豆氨基酸残基序列进行多重比较，并构建系统进化树(图3)。根据氨基酸残基的进化程度和同源性关系，将其分为3个亚组，其中烟草处于第二亚组。在整体进化关系中，烟草和碧桃的亲缘关系较近，抗性方面的功能更加相近，反映了2个物种抗性功能在一定范围内可以相互借鉴。

表2 bZIP转录因子BZI-4的亚细胞定位

注：Ph为菜豆，Gl为大豆，Pr为碧桃，To为烟草，Ar为拟南芥，Ze为玉米。Note：Ph stand for Phasedus vulgaris, Gl stand for Glycine max, Pr stand for Prunus persica, To stand for Tobacco, Ar stand for Arabidopsis thaliana, Ze stand for Zea mays.图3 bZIP转录因子BZI-4的系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of bZIP transcription factor BZI-4

3 结论与讨论

该研究结果表明，烟草bZIP转录因子BZI-4在采前生理期及烘烤过程中的变黄阶段等逆境条件下发挥作用，对逆境环境反映迅速，从而使烟草快速适应逆境环境。烟草bZIP转录因子BZI-4抵抗逆境的范围广，能够参与烟草植株对病毒和菌害的抵抗、烟草的光信号[12]、烟草植株的生长发育、烟草种子的成熟、烟株在温度过度变化等外界各种不利逆境胁迫的抵抗[13]。烟草bZIP转录因子BZI-4具有较强的适应性，在逆境胁迫前已存在叶绿体中，但无活性，在逆境胁迫的条件下激活修饰蛋白对其进行剪切修饰，使其发挥作用。

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Biological Information Analysis of bZIP Transcription Factor BZI-4 in Tobacco

LI Bing-ze1, WANG De-xun2, XU Cheng-long3, SU Jia-en2*

(1. Heqing County Branch of Dali Prefecture Tobacco Company, Heqing, Yunnan 672100; 2. Dali Prefecture Company, Yunnan Tobacco Company, Dali, Yunnan 671000; 3. Xiangyun County Branch of Dali Prefecture Tobacco Company, Xiangyun, Yunnan 672100)

[Objective] To discuss the related factors of resistance to stress in the physiological period of tobacco before harvesting and baking yellowing stage. [Method] The physical and chemical properties, signal peptide, transmembrane, system evolution and subcellular localization of tobacco bZIP transcription factor BZI-4 were analyzed by bioinformatics methods. [Result] Tobacco bZIP transcription factor bzi-4 was alkaline water solubility and relative stability, high heat resistance, non-secretion type of free protein. The protein might be existed in chloroplast transit peptide, its activity must be exerted through the amino acid sequence of shear, and the condition of adaptive evolution was moderate. [Conclusion] The study of bZIP transcription factor BZI-4 in tobacco provides a theoretical basis for the study of tobacco resistance to stress.

Biological information; Transcription factor; bZIP; Tobacco

云南省烟草公司科技计划项目“提高红花大金元品种烟叶可用性配套烘烤技术研究”(2013YN29)。

李炳泽(1969- )，男，云南鹤庆人，助理农艺师，从事烟叶生产技术指导工作。*通讯作者，高级农艺师，从事烘烤技术研究及推广工作。

2016-08-31

S 188

A

0517-6611(2016)31-0156-02