电刺激改善牛肉嫩度的蛋白质组学研究

沈 瑾

(山东省新泰市农业局，山东新泰 271200)



电刺激改善牛肉嫩度的蛋白质组学研究

沈 瑾

(山东省新泰市农业局，山东新泰 271200)

[目的]研究电刺激处理对宰后成熟过程中牛肉蛋白质的影响。[方法]利用牛背最长肌双向电泳凝胶体系研究电刺激后牛背最长肌中的差异蛋白质，分析宰后1和3 d时电刺激处理牛背最长肌中有显著降解的差异蛋白点。[结果]与未电刺激样品相比，在宰后1和3 d电刺激处理牛背最长肌中有12个蛋白点表达明显下调，分为9种蛋白质：肌间线蛋白、肌钙蛋白-T、肌球蛋白结合蛋白H；肌酸激酶、磷酸丙糖异构酶；过氧化物氧化还原酶、磷脂酰乙醇胺结合蛋白；组蛋白、甲基转移酶。[结论]电刺激后9种蛋白质通过4条途径影响电刺激后嫩度变化，包括糖酵解代谢途径、钙激活中性蛋白酶途径、溶酶体途径和氧化应激途径。电刺激通过通过4条途径影响嫩度的信号通路表明，牛肉嫩化与氧化、凋亡有密切联系；电刺激在一定程度上抑制增殖，加速氧化和凋亡，加快嫩化。

牛背最长肌；电刺激；嫩度；蛋白质降解；差异蛋白质组

嫩度是决定牛肉食用品质的最重要指标[1]。大量调查表明，消费者可以将不同嫩度的肉区分出来，并愿意以高价购买嫩度较好的牛肉。嫩度的高低在一定程度上决定牛肉食用品质的优劣[2]。牛肉的嫩度除受肉牛年龄和品种等生理方面的影响外，还包括牛屠宰后所采取的处理方式，如冷却处理、电刺激处理等。电刺激处理对宰后成熟过程中牛肉蛋白质降解的影响仍是肉品界的研究热点。研究表明，电刺激确实提高了宰后肌肉蛋白质的降解速度，其原因可能是电刺激导致蛋白质的降解。蛋白质组学的核心为双向凝胶电泳和质谱技术，笔者研究电刺激处理对宰后成熟过程中牛肉蛋白质的影响，以期为研究牛肉嫩度的改善提供新的思路。

1　材料与方法

1.1材料选择体重(629.0±50.3)kg、18月龄的杂交黄牛(延边牛×西门塔尔牛)20头，并随机分成2组。肉牛按伊斯兰屠宰流程屠宰。宰后5 min内，对其中一组进行电刺激(EST-601型电刺激仪，电压为42 V，电流为0.7 A，频率为50 Hz，时间为40 s；Electrical stimulation-ES)，另一组未电刺激为对照组(No electrical stimulation-NS)。胴体剥皮、劈半后进入成熟车间(0～4 ℃，湿度90%，风速0.5 m/s)冷却、成熟，宰后1、3 d时在胴体12～13肋骨间取50 g肉块放入液氮内速冻后保存在-80 ℃，备用。

1.2样品处理取冷冻肌肉组织100 mg，加入1 mL裂解液孵化40 min，裂解液含8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2% CHAPS、65 mmol/L DTT、1%两性电解质(pH 3～10)。12 000 r/min离心60 min，取上清，使用2D quant kit 定量试剂盒进行蛋白浓度定量，分装到离心管，保存于-80 ℃备用。

1.3双向电泳将含有400 μg样品的再水化液加到24 cm IPG胶条中，过夜使胶条再水化。再水化液包括8 mol/L尿素、0.5% CHAPS、0.28% DTT、1%IPG buffer(pH 3～10)、10%甘油、溴酚蓝，等电聚焦条件为50 V水化12 h，100 V 2 h，200 V 1 h，500 V 30 min，1 000 V 20 min，3 000 V 20 min。等电聚焦后，在10 mL含50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、6 mol/L 尿素、2% SDS、20%甘油、溴酚蓝、5 mmol/L TBP的平衡液中平衡IPG胶条，然后将平衡后的IPG胶条转移到12.5% SDS凝胶上，进行第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，最初使用每块胶10 mA 1 h，待蛋白质样品在SDS-PAGE凝胶的浓缩胶上浓缩成一条线后，开始使用每块胶20 mA，直至溴酚蓝到达底部边缘时停止电泳。凝胶在含考马斯亮蓝G-250、95%乙醇、85%磷酸的染色液中染色，摇床振荡30 min，使用超纯水脱色2 h。电泳图谱染色完毕后，采用扫描仪对双向电泳凝胶图进行扫描分析，分辨率为300 dpi。采用凝胶图像分析软件PDQuest7.0分析图像，对双向电泳凝胶上的差异蛋白点进行检测分析，考染后有2倍以上差异的蛋白点被鉴定出来，最后对差异蛋白点进行质谱分析。

2　结果与分析

经考马斯亮蓝染色的双向电泳凝胶通过计算机辅助图像软件的分析，检测到650～669个点。宰后1和3 d时电刺激处理样品的双向电泳凝胶图谱见图1、2。

注：蛋白质上样量为400 μg，胶条pH 3～10，胶条长度24 cm，SDS凝胶为12.5%。Note：Protein(400 μg)was loaded and separated in the IPG 3-10 strip(24 cm)and an SDS gel(12.5% T).图1　宰后1 d时电刺激与未电刺激处理牛背最长肌蛋白质表达的比较Fig.1　Comparative analysis of the expressed protein patterns between no simulated group and 1 d post-ES group

对宰后1和3 d时ES和NS处理样品经双向电泳并对凝胶染色后，使用PDQuest2D软件对不同凝胶重复性进行分析，发现有6个蛋白质点的蛋白丰度差异达2倍以上。对双向电泳后得到的显著差异蛋白质点进行质谱分析，得到肽质量指纹图谱(PMF)。以MASCOT离子搜索模式，检索NCBI真核生物的蛋白质数据库，共成功鉴定出12个蛋白点。其中，细胞骨架蛋白4个，激酶抑制蛋白1个，代谢酶4个，过氧化物氧化还原酶2个，甲基转移酶1个(表1、2)。

注：蛋白质上样量为400 μg，胶条pH 3～10，胶条长度24 cm，SDS凝胶为12.5%。Note：Protein(400 μg)was loaded and separated in the IPG 3-10 strip(24 cm)and an SDS gel(12.5% T).图2　宰后3 d时电刺激与未电刺激处理牛背最长肌蛋白质表达的比较分析Fig.2　Comparative analysis of the expressed protein patterns in between no simulated group and 3 d post-ES group

表1　宰后1 d时电刺激处理牛背最长肌样品中鉴定的差异蛋白点

表2　宰后3 d时电刺激处理牛背最长肌样品中鉴定的差异蛋白点

由表1、2可知，与未电刺激样品相比，在宰后1和3 d电刺激处理牛背最长肌中有12个蛋白点表达明显下调，分为9种蛋白质：肌间线蛋白(Desmin)、肌钙蛋白-T(Troponin T alpha isoform)、肌球蛋白结合蛋白H(Myosin binding protein H)；肌酸激酶(Creatine kinase，2个)、磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase，2个)；过氧化物氧化还原酶(Peroxiredoxin-6，2个)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白(Phosphatidylethanolamine-binding protein)；组蛋白(Histone H3.3-like isoform 2)、甲基转移酶(Methyltransferase)。

3　讨论

3.1电刺激通过糖酵解代谢途径影响嫩度动物屠宰后，肌肉中的能量代谢系统从有氧代谢转为无氧代谢，ATP主要来源于糖原降解为乳酸及磷酸肌酸中磷酸转移给ADP[3]。肌酸激酶能够催化ATP与ADP间磷酸基团的可逆转移。研究表明，电刺激能够加速宰后的糖酵解[4-6]，且发现有些代谢酶因为电刺激而导致表达改变[7]。另外，在糖酵解及糖异生过程中，磷酸丙糖异构酶(TIM)发挥了作用，催化3-磷酸甘油醛与磷酸二羟丙酮[8]间的转换。磷酸丙糖异构酶已被用作药物设计的一个靶目标[9]。屠宰后糖酵解酶的增加有可能是为了增加糖酵解速率，以维持ATP的生成。因此，电刺激后代谢酶Creatine kinase和Triosephosphate isomerase表达下调，表明电刺激加快糖酵解途径，Creatine kinase和Triosephosphate isomerase快速消耗，防止肌肉快速冷却时的冷收缩，使胴体内能量大量消耗，ATP转化ADP为磷酸盐，释放出钙离子，乳酸积累，形成高温低pH环境，嫩度提高。

3.2电刺激通过钙激活中性蛋白酶途径影响嫩度研究表明，细胞骨架蛋白Titin、Nebulin、Desmin和Troponin-T的降解使肌原纤维发生一系列的物理、化学和结构的变化，导致肌纤维小片化，破坏了肌纤维结构的完整性，并最终改善了肉嫩度[10-11]。电刺激电流通过神经系统或直接使肌膜去极化引起肌肉收缩，使肉的糖酵解速率提高，肉胴体温度升高，pH迅速降低，进而影响Calpain/Calpastatin的比例[12]，也可能是肌浆钙离子浓度较高激活Ca1pains蛋白酶体系，蛋白质降解加速，并最终导致肉的快速嫩化。电刺激后骨架蛋白Desmin、Troponin T alpha isoform、Myosin binding protein H表达下调，表明电刺激激活Calpains蛋白酶体系，加速降解骨架蛋白Desmin、Troponin T alpha isoform、Myosin binding protein H，剪切力降低，嫩度提高。

3.3电刺激通过溶酶体途径影响嫩度溶酶体内的酶均属于酸性水解酶，反应的最适pH为5.0左右，溶酶体膜有质子泵，将H+泵入溶酶体，使其pH降低。如果细胞pH下降至5.0左右，会导致酸性水解酶活化，水解溶酶体膜，最终导致溶酶体膜裂解，溶酶体酶释放，使细胞、组织自溶。当细胞中pH接近中性时，Peroxiredoxin-6在肌浆中发挥过氧化物氧化还原酶活性，当细胞中pH为5.0左右时，Peroxiredoxin-6在溶酶体发挥Ca2+依赖的磷脂酶 A2活性，利用溶酶体途径来调控肉类中骨架蛋白的降解[13-14]。电刺激后Peroxiredoxin-6表达下调，表明电刺激后pH不断下降，直到pH为5.4左右，肌浆中Ca2+浓度升高，Peroxiredoxin-6主要发挥Ca2+依赖的磷脂酶 A2活性，导致溶酶体膜破裂，溶酶体内的水解酶释放，使肌肉蛋白水解，嫩度提高。

3.4电刺激通过氧化应激途径影响嫩度Peroxiredoxin是近年来发现的可以保护机体细胞免受氧化剂损伤的蛋白质家族，可以清除机体内的H2O2和烷基过氧化物，通过其过氧化物酶活性，保护细胞免受氧化损伤。Peroxiredoxin-6是一个双功能蛋白，具有过氧化物酶和磷脂酶A2双重活性。Peroxiredoxin-6在pH接近中性时，发挥过氧化物氧化还原酶活性，通过p38 MAPK级联途径刺激增殖和抑制细胞凋亡[15-17]。电刺激后Peroxiredoxin-6表达下调，表明电刺激后pH不断下降，直至pH为5.4左右，肌浆中Ca2+浓度升高，Peroxiredoxin-6主要发挥Ca2+依赖的磷脂酶 A2活性，通过溶酶体途径使肌肉蛋白水解，在一定程度上抑制了p38 MAPK级联途径，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。

哺乳动物中的PEBP具有双重作用，包括脂质结合及使丝氨酸蛋白酶受到抑制[18]。牛屠宰后胴体内产生活性氧，激活Ras-MAPK级联途径，PEBP与Raf-1相互起作用，抑制Ras-MAPK信号转导途径。电刺激后PEBP表达下调，表明电刺激加速PEBP抑制Ras-MAPK级联途径，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。PI3K/Akt信号转导通路诱导细胞的增殖，避免细胞发生凋亡，且能够激活甲基转移酶MT[19-20]。而MT表达越低，甲基化水平越低，凋亡越快。电刺激后组蛋白和甲基转移酶下调，表明甲基转移酶表达降低，组蛋白甲基化水平降低，加速凋亡，在一定程度上抑制PI3K/Akt信号转导通路，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。

电刺激后Peroxiredoxin-6、PEBP、Histone、MT表达下调，表明电刺激通过抑制p38 MAPK级联途径、Ras-MAPK级联途径和PI3K/Akt信号通路，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。

4　结论

该研究运用蛋白质组学方法研究了电刺激宰后1和3 d牛背最长肌中降解的蛋白质。利用双向电泳技术和软件分析鉴定，确定在电刺激宰后1和3 d牛背最长肌中有12个蛋白点表达明显下调，分为9种蛋白质：肌间线蛋白(Desmin)、肌钙蛋白-T(Troponin T alpha isoform)、肌球蛋白结合蛋白H(Myosin binding protein H)；肌酸激酶(Creatine kinase，2个)、磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase，2个)；过氧化物氧化还原酶(Peroxiredoxin-6，2个)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白(Phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP)；组蛋白(Histone H3.3-like isoform 2)、甲基转移酶(Methyltransferase)。分析电刺激处理后的差异蛋白质影响嫩度的作用机制表明，电刺激处理后鉴定的9种差异蛋白质主要通过4条途径影响嫩度变化，分别为糖酵解代谢途径、钙蛋白酶途径、溶酶体途径、氧化应激途径。电刺激通过氧化应激途径影响嫩度的信号通路表明，牛肉嫩化与氧化、凋亡有密切联系；电刺激在一定程度上抑制增殖，加速氧化和凋亡，加快嫩化。具体机制还需要进一步试验验证。

该研究鉴定出的代谢酶为进一步研究成熟嫩化、氧化和凋亡提供了新思路，如对牛肉中基因进行分离及遗传效应分析，基因的敲除或者过表达，启动子克隆和转录因子的研究，可以进行基因结构、时空表达谱、多态性及性状关联分析等方面的研究，建立与嫩度的关系，从而指导生产。从基因水平上，进一步研究代谢通路及基因网络具有重要的理论意义。

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The Proteomic Analysis of Beef Tenderness after Electrical Stimulation

SHEN Jin

( Xintai Agricultural Bureau,Xintai,Shandong 271200)

[Objective]To research the effects of electrical stimulation (ES) on beef protein in the mature process after slaughter.[Method]The differential proteins were identified using the system of two-dimensional electrophoresis gels on muscle longissimus to analysis the relations to tenderness in this system.Differential protein spots with significant degradation during muscle longissimus ES were analyzed after 1 and 3 d of slaughtering.[Result]Compared with no ES samples,twelve protein spots were down-regulated significantly at 1 and 3 d postmortem as a result of electrical stimulation.These proteins were identified as nine types: desmin,troponin T alpha isoform,myosin binding protein H,creatine kinase,triosephosphate isomerase,peroxiredoxin-6,phosphatidylethanolamine-binding protein,histone H3.3-like isoform 2,methyltransferase.[Conclusion]Proteins of nine types affects tenderness as a result of electrical stimulation through four pathways including glycolytic metabolic pathway,calpains pathway,lysosomal pathway,and oxidative stress pathway.These pathways indicate that meat tenderness is closely related to oxidation and apoptosis,electrical stimulation inhibites proliferation,accelerates oxidation and apoptosis and finally accelerates meat tenderization.

Muscle longissimus;Electrical stimulation;Tenderness;Protein degradation;Differential proteomics

沈瑾(1983- )，女，山东新泰人，农艺师，博士，从事食品科学研究。

2016-07-20

TS 201.2+1

A

0517-6611(2016)25-112-04