赤点石斑鱼FAS基因的克隆及序列分析

陈斯钰,张 芮,杨云霞

(浙江海洋大学水产学院,浙江舟山 316022)



赤点石斑鱼FAS基因的克隆及序列分析

陈斯钰,张 芮,杨云霞*

(浙江海洋大学水产学院,浙江舟山 316022)

[目的]研究赤点石斑鱼 (Epinephelus akaara) FAS基因的结构与表达特性。[方法]以前期获得的转录组序列作为数据库，应用PCR技术，获得赤点石斑鱼FAS 基因的cDNA全序列。[结果]该序列与大黄鱼(Larimichthy scrocea)FAS基因的相似度最高，为87%。该序列全长8 505 bp，包括712 bp的3′UTR区、7 548 bp的开放阅读框(ORF)以及245 bp的5′UTR区，可编码2 515个氨基酸。经预测，该蛋白分子量为274.03 ku，等电点为5.98，其属于亲水性蛋白。通过Real-time PCR方法获得FAS在赤点石斑鱼各个组织中的表达，结果显示，其在心脏中表达量最高，其次是在肝脏中。FAS基因的进化与物种进化一致。[结论]该研究为进一步研究赤点石斑鱼脂肪代谢奠定理论基础，也为赤点石斑鱼在养殖方面的工作提供基础资料。

赤点石斑鱼；FAS基因；组织分布

赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)俗称红斑、红过鱼，隶属于鲈形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)石斑鱼属(Epinephelus)，是我国南方名贵的经济养殖鱼类[1]。其属于亚热带暖温性底层鱼类，多生活于岩礁底质的海域，一般不结成大群，喜光线较暗区域，主要摄食鱼类和虾类[2]，主要分布于北太平洋西部，我国产于舟山群岛以南经台湾海峡至南海、北部湾一带海域。赤点石斑鱼富含EPA、DHA等高不饱和脂肪酸，可预防心血管等疾病发生。赤点石斑鱼肉味鲜美，又因人们认为其身上的红斑为吉祥之意，故市场上售价很高，是香港、广东的主要养殖品种[3]。

FAS(fatty acid synthetase)基因是生物体内脂肪酸合成的关键酶，当其表达水平和活性升高时，会显著增加甘油三脂在体内的沉积[4-6]；当其活性受到抑制时，会阻滞生脂通路、减少脂肪的合成，还会造成丙二酰COA浓度的升高，降低食欲[7]。为深入了解FAS基因，很多学者对FAS功能、表达活性、调控机制等方面进行了研究[8-14]。迄今为止，人们已分离得到人脂肪酸合成酶代谢调控基因，发现其脂肪酸合成酶基因位于17q25[15]，另外，牛的基因位于19q22，鸡的基因位于18号染色体上[16]。此外，还有学者对绵羊肌肉中FAS基因表达的发育性变化进行了研究，发现FAS基因mRNA水平在哈萨克羊肌肉中初生时最高(P<0.05)，随日龄的增加呈下降趋势；在新疆细毛羊肌肉中，FASmRNA水平则表现出“下降-上升-下降-上升”的发育模式，其中，60日龄显著高于90日龄(P<0.05)，其余日龄之间差异不显著[17]。另有学者研究了不同填饲期肥肝鹅肝脏组织中不同脂肪酸沉积与脂肪酸合成酶FAS基因mRNA的表达丰度及相关性，发现FAS基因mRNA的表达对肥肝鹅肝脏中脂肪的沉积具有填饲前、中期快速增加，填饲后期下降的调控作用[18]。熊文中等[19]研究发现，猪脂肪组织中脂肪酸合成酶和酮体脂肪量具有极显著(P<0.01)的正相关关系。

关于FAS基因在哺乳动物上的研究已很深入，而在鱼类上，研究者对FAS的研究仅局限于FAS活性研究，对其基因研究相对较少。目前，GenBank 数据库上仅见预测的斑马鱼 Danio rerio FAS基因mRNA全序列 (GenBank:XM_001923608.2) 以及吉富罗非鱼 Oreochromis niloticus (GenBank:GU433188.1)、黑鲷 Acanthopagrusschlegelii (GenBank:EU780581.1)、军曹鱼 Rachycent roncanadum (GenBank:FJ842647.1)、点带石斑鱼Epinephelus coioides (GenBank:FJ196231.1)、黑青斑河豚 Tetraodonnigroviridis (GenBank:CAF94659.1)等少数鱼类的FAS基因部分mRNA序列。关于赤点石斑鱼的FAS基因，目前尚未见相关方面的研究。笔者以赤点石斑鱼为研究对象，研究赤点石斑鱼FAS基因的克隆及序列分析，为进一步研究赤点石斑鱼脂肪代谢奠定理论基础，也为赤点石斑鱼在养殖方面的工作提供基础资料。

1　材料与方法

1.1试验材料赤点石斑鱼来自浙江海洋大学分子生物学实验室。将赤点石斑鱼暂养7 d后，选择外观无明显病状、较为健康的赤点石斑鱼。在超净工作台上进行无RNA操作：将其解剖后，获得头肾、脑、肠、脾、腹肌、肝、鳃、胃、心脏、背肌等组织。将各组织用锡箔纸包裹，做好标记后，放入-80 ℃的冰箱中冷冻保存备用。

1.2引物设计在NCBI网站上下载与赤点石斑鱼相似的其他鱼类FAS基因序列，即大黄鱼 (Larimichthys crocea KP889061.1)、军曹鱼(Rachycentron canadum FJ842648.1)、罗非鱼 (Oreochromis niloticus GU433188.1)、南极鳕鱼 (Notothenia coriiceps XM_010792091.1) 的FAS基因序列，遵循引物设计原则，采用引物设计软件Primer Premier 5.0[20]和评估软件PrimerSelect设计上、下游引物。由测序结果获得FAS基因片段，同时结合转录组测序的结果，获得赤点石斑鱼FAS基因的开放阅读框(Open read frame ,ORF) 序列,设计半定量RT-PCR反应引物。引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。EA-fas-CF：3′-CTTGATGGGTGTGGAGGTTCG-5′，EA-fas-CR：3′-AGTCTCGGCTGATGTTCTTGTG-5′；EA-fas-RT-ZF：3′-GCCAACAGCAAGCCAGAATCTC-5′，EA-fas-RT-ZR：3′-GCAGCAGTGGAGCCCTCAAT-5′；β-actin-F：3′-CGACCTCACAGACTACCT-5′，β-actin-R：3′-AACGGAACCTCTCATTGC-5′。

1.3试验方法

1.3.1总RNA的提取并检测。取各新鲜组织于Eppendorf 离心管中,采用Trizol法，通过取样、处理、去蛋白、沉淀、洗涤、干燥、溶解等步骤，提取各个组织的总RNA。并将所提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2cDNA模板的制备及FAS基因序列全长的获得。根据RNA的检测浓度，取各组织RNA 2 μL于Eppendorf离心管中，再加入2.0 μL Buffer、0.5 uL oligo(dT)、0.5 μL Random.6、0.5 μL mix，最后加4.5 μL RNase FreedH2O补足。将PCR仪反应程序设置为37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃后，进行反转录，得到cDNA，最后加入40.0 μL ddH2O进行稀释，获得cDNA模板，放入4 ℃冰箱中备用。

利用合成的引物(EA-fas-CF、EA-fas-CR)，并结合脑、胃、心脏等模板进行中间片段的PCR扩增。根据说明书添加如下反应体系：10×Buffer 3.0 μL、dNTP 2.0 μL、上下引物各0.4 μL、rTaq 0.2 μL、模板0.6 μL、ddH2O 23.4 μL。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；最后72 ℃延伸8 min。当PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择检测结果具有明亮条带的PCR产物，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行纯化、克隆，获得基因序列，再以实验室前期获得的转录组序列作为数据库，搜索获得FAS基因序列，并通过NCBI数据库Blast程序进行序列验证。

1.3.3RT-PCR扩增。以β-actin作为参考基因，重新设计RT-PCR引物(EA-fas-RT-CF、EA-fasR-T-CR)，以脑、肠、脾、腹肌、肝、鳃、胃、心脏、背肌作为模板进行RT-PCR扩增。每个样品进行3次重复扩增，每组反应体系：premix 7.5 uL、模板 1.0 μL、上下引物各0.6 μL、ddH2O 6.3 μL。RT-PCR扩增反应程序：95.5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

1.4数据分析所得数据采用2-ΔCt法，计算FAS基因在赤点石斑鱼各组织中的相对表达量。

2　结果与分析

2.1总RNA检测结果将所提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。由图1可知，在每个组织中均能观察到28S、18S、5S 3条明亮、清晰的条带。

注：1.脑；2.肠；3.脾；4.腹肌；5.肝；6.鳃；7.胃；8.心脏；9.背肌。Note: 1.Brain;2.Intestine;3.Spleen;4.Abdo minal muscle;5.Liver;6.Gills;7.Stomach;8.Heart;9.Back muscle.图1　赤点石斑鱼9个组织的总RNA电泳分析Fig.1　Electrophoretic analysis of total RNA expression in nine tissues of Epinephelus akaara

2.2FAS基因cDNA全长序列及其编码氨基酸序列利用赤点石斑鱼肝脏的转录组数据，以及与其他物种FAS基因序列，通过PCR扩增和克隆测序分析，拼接得到cDNA全序列长度为8 505 bp。由ORF-Finder检索得到，该序列由7 548 bp编码区、712 bp的3′UTR区和245 bp的5′UTR区组成，共编码2 515个氨基酸。经ProtParam (http://web.expasy.org/ protparam)软件分析，预测赤点石斑鱼FAS蛋白质分子量为274.03 ku，等电点为5.98。利用ProtScale (http://web.expasy.org/protscale)在线预测赤点石斑鱼FAS的氨基酸亲/疏水性，结果显示，赤点石斑鱼FAS蛋白序列中疏水性氨基酸残基所占面积小于亲水性氨基酸残基，其中，疏水性最大值为2.689，亲水性最大值为3.000，可以推测该蛋白属于亲水性蛋白。此外，经过SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)在线预测，得知FAS蛋白有2个特有的结构域，一个是PKS_ER 结构域(位于第1 549～1 864个氨基酸)；另一个是PKS_KR结构域(位于第1 896～2 077个氨基酸)。

2.3FAS基因的同源性和系统进化分析利用NCBI数据库Blast程序进行序列验证，结果显示，该序列与大黄鱼(Larimichthy scrocea)、深裂眶锯雀鲷(Stegastes partitus)、罗非鱼(Stegastes partitus)等的FAS基因核苷酸序列均有较高的相似度，分别为87%、86%、83%。选取NCBI上已知的鱼类及其他高等脊椎动物的FAS基因序列，运用软件ClustalX进行多序列比对分析，并以MEGA5.1软件中的邻接法(Neighbor Joining)构建多物种的FAS基因系统发生树(图2)。由图2可知，所获得的进化树由2个主要分支组成，其中一支主要分支又分为两分支，一支为各种鱼类，一支为原鸡和热带爪蟾，另一支主要分支为人和小鼠。

图2　基于FAS氨基酸序列构建脊椎动物系统进化树(NJ树)Fig.2　Phylogenetic tree of vertebrates based on FAS a mino acid sequence

2.4赤点石斑鱼FAS基因在各组织中的差异表达为研究赤点石斑鱼不同组织FAS表达的差异性,通过RT-PCR对赤点石斑鱼9个组织的FAS相对表达量进行检测。结果表明，FAS基因在各个组织中均有表达(图3)，但不同组织中的表达量明显不同，心脏中相对表达量最高，为0.069；其次是肝和肠，表达量分别为0.017和0.015；而脑与脾的表达量相同，均为0.011；在腹肌、鳃、胃、背肌中的相对表达量差异不大，分别为0.007、0.003、0.002、0.003。

图3　赤点石斑鱼FAS基因在不同组织中的表达情况Fig.3　Tissue expression of FAS gene in different tissues of Epinephelus akaara

3　讨论

脂肪酸合成酶是一种多功能酶复合物，在动物生命活动中发挥重要作用，其最早是在鹅的肝脏中发现的，随后研究者对人、鼠、猪、牛也进行了相关方面的研究[21-23]。该研究获得FAS基因全序列，其全长为8 505 bp，由712 bp的3′UTR区、7 548 bp的开放阅读框(ORF)以及245 bp的5′UTR区组成，共编码2 515个氨基酸。该序列与大黄鱼FAS基因序列相似度最高，为87%，其高度保守性揭示鱼类FAS蛋白可能具有相似的功能和特性，在动物生长过程中起重要作用。经预测，FAS蛋白属于亲水性蛋白，蛋白分子量为274.03 ku，等电点为5.98。且FAS蛋白具有2个特有的结构域，分别为PKS_ER 结构域和PKS_KR结构域，这2个结构域在生物脂肪酸合成过程中起关键性作用。此外，通过构建FAS基因系统发育树，发现赤点石斑鱼与大黄鱼、军曹鱼亲缘关系更接近，与人和小鼠的亲缘关系最远，而与原鸡、热带爪蟾在FAS基因进化上比哺乳类有更近的亲缘关系。该结果不仅支持了硬骨鱼类的单系起源，也显示脊椎动物从水生到陆生的进化轨迹，反映了物种间的进化关系。

该研究通过RT-PCR扩增发现赤点石斑鱼FAS基因在脑、肠、脾、腹肌、肝脏、鳃、心脏、胃、背肌等组织中均有表达，且在心脏中表达量最高，其次是在肝脏中。FAS基因的表达直接影响脂肪酸合成酶的多寡，对鱼体内脂肪酸的合成具有极大影响。关于脂肪酸合成部位，研究表明，脂肪酸的合成部位在不同物种中具有差异性，哺乳动物主要在脂肪组织中合成脂肪酸，而家禽脂肪酸合成部位主要在肝脏，由肝脏合成的脂肪酸约占总量的90%[24]。研究发现，不同鱼类在不同组织中FAS基因mRNA表达量不同，瓦氏黄颡鱼 (Pelteobaggrus vachelli) 在肠道中表达量最高，且显著高于其他组织，肝脏组织中的表达量显著高于肌肉、脑组织和腹腔脂肪组织[25]；匙吻鲟 (Polyodon spathula)在肝脏中表达量最高，其次是在腹腔脂肪中，在胃中表达量最低；而鳙 (Aristichthysnobilis) 在咽器官表达量最高，其次在肠道组织中，在鳃中表达量最低[26]。研究发现，吉富罗非鱼肝脏中FASmRNA的表达丰度高于肌肉,且饲料脂肪水平能够抑制FASmRNA表达,脂肪水平越高抑制作用越明显[27]。由于个体差异，不同物种在不同生长条件下，各个组织中FAS基因mRNA表达量不同。该研究对赤点石斑鱼不同组织中FAS基因不同表达量的探索，对脂肪酸合成调控研究具有一定的现实意义，通过对组织中脂肪酸合成酶量的调节，可以有效地控制鱼体内脂肪的沉积，从而提高鱼肉品质。因此，对FAS基因mRNA表达的时空性及不同条件下的表达调控需要在今后研究中进一步探索。

随着分子生物学技术的出现和不断成熟，人们从分子生物学水平对脂肪代谢的调控进行了一定探索性的研究。而该研究获得的赤点石斑鱼FAS基因全长序列，为进一步对赤点石斑鱼脂肪相关的研究以及育种提供了理论基础，同时也为今后研究赤点石斑鱼与鲈鱼目等近缘物种间分子进化和遗传分化奠定理论基础。

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Cloning and Sequence Analysis of FAS Gene in Epinephelus akaara

CHEN Si-yu,ZHANG Rui,YANG Yun-xia*

(College of Fishery,Zhejiang Ocean University,Zhoushan,Zhejiang 316022)

[Objective]To research the structure and expression characteristics of FAS (Fatty Acid Synthase) gene in Epinephelus akaara.[Method]With the transcriptome sequence obtained in previous research as the database,PCR technology was used to obtain the cDNA sequence of FAS gene in E.akaara.[Result]This sequence had high similarity with that of Larimichthy scrocea (87%).The total length of FAS gene was 8 505 bp,which included 712 bp 3′UTR,7 548 bp open reading frame (ORF),and 245 bp 5′UTR.A total of 2 515 amino acids were encoded.The protein molecular weight was 274.03 ku,isoelectric point was 5.98,and it belonged to the hydrophilic protein.Results of Real-time PCR showed that FAS gene had the highest expression in heart,followed with liver.Evolution of FAS gene was in accord with that of species.[Conclusion]This research lays theoretical basis for the fat metabolism of E.akaara,and provides basic data for the cultivation of E.akaara.

Epinephelus akaara;FAS gene;Tissue distribution

浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划项目(2016R411016)；浙江海洋学院科研启动经费项目(Q1418)；浙江海洋大学大学生科技创新项目(xj201512)。

陈斯钰(1995- )，女，浙江绍兴人，本科生，专业：水产养殖。*通讯作者，讲师，博士，从事动物分子营养研究。

2016-07-08

S 965.334

A

0517-6611(2016)25-109-03