性别对家禽粪便微生物多样性及功能的影响

林俊 赵英光

摘要 为研究性别对家禽粪便微生物的影响，选择成年鸡、鸭和鹅为试验动物，在相同饲养条件下饲喂相同的饲料28 d后，收取新鲜粪样后检测粪便样品的16S rDNA的V4区，分析群落多样性和丰度，并进行差异菌落功能注释。结果表明，性别对鸡和鸭粪便α微生物多样性有显著或极显著影响（P<0.05或P<0.01），而对鹅粪便微生物多样性没有显著影响;β多样性分析结果表明，饲喂相同的饲料给不同性别的家禽（鸡、鸭、鹅），不同性别的家禽粪便中微生物群落组成和结构有明显区别;不同性别的鸡、鸭和鹅粪便微生物中50、78和247个属的微生物丰度有显著或极显著差异（P<0.05或P<0.01）;大量的差异属微生物的功能聚集在代谢、免疫功能等方面。该研究表明性别对鸡、鸭和鹅粪便中微生物多样性和丰度有显著或极显著影响（P<0.05或P<0.01），进而影响粪便的功能和宿主。

关键词 粪便微生物;多样性;性别;鸡;鸭;鹅

中图分类号 S811.6 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）03-0085-04

Abstract In order to investigate the effects of gender on the fecal microbe in poultry， we selected adult chicken， ducks and geese as experimental animals. In the same environment， those animals were reared with the same diet for 28 days， fresh fecal were collected to detect the V4 region of 16S rDNA in fecal samples and analyze the community diversity and abundance. And differential colony function annotation was made. The results showed that gender had significant or extremely significant effects on alpha microbial diversity in the feces of chicken and ducks （P<0.05 or P<0.01）， but it had no significant effect on the microbial diversity in goose feces.The results of beta diversity analysis showed that there were significant differences in the composition and structure of microbial communities in feces microbe in different genders of chicken， duck or goose with feeding the same feed. There were significant or extremely significant differences of microbial abundance in 50， 78 and 247 genera in the feces of chicken， ducks and geese between different genders （P<0.05 or P<0.01）. A large number of differences in the microbial function were concentrated in the metabolism， immune function and so on.In conclusion， gender had significant or extremely significant effects （P<0.05 or P<0.01） on microbial diversity and microbial abundance in the feces of chicken， duck and goose， which affected fecal function and host.

Key words Fecal microbe;Diversity;Gender;Chicken;Duck;Goose

腸道微生物影响宿主的营养、免疫、生产性能、生理状态和疾病等过程[1]。微生物通过发酵、消化等过程消化饲料中的淀粉、纤维素等物质，为机体提供短链脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）、氨基酸和维生素等[2]，并通影响黏膜分泌免疫球蛋白或非特异性免疫、免疫应答等过程而提高机体的健康状况或生产性能[3]。性别、环境、日龄和饲粮等因素均影响肠道菌群。研究发现，同一物种不同性别在炎症反应和免疫反应过程中分泌的激素、调控的基因不同，会影响肠道微生物的组成和物种多样性[4]。关于哺乳动物的研究表明，性别影响肠道微生物T细胞介导的炎症反应和细胞因子产生的不同反应[5]，小肠中的微生物参与小肠的免疫反应[6];对哺乳动物的研究发现，性别影响肠道微生物组成[7]，进一步研究发现性别主要是通过不同性别肠道微生物中的拟杆菌-普雷沃菌（Bacteroides-Prevotella）的差异而造成不同影响[8]。笔者选择鸡、鸭和鹅饲喂28 d相同饲粮后收集粪便样品，并利用高通量测序技术检测分析群落多样性和组成成分，对差异菌落进行基因功能注释，分析性别对粪便微生物的影响，旨在为后续研究禽类微生物的组成提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择30只成年鸡（15♂、15♀）、30只成年鸭（15♂、15♀）和26只成年鹅（12♂、14♀）在重庆市农业学校家禽科研基地进行饲养。所有动物都饲养在相同的试验条件下，每天饲喂相同的全价饲料（表1），饲喂量为200 g/（d·只），饲喂28 d后将试验个体放置在无菌的塑料薄膜上，并收集粪便样品冻存在干冰中，随后冻存在-80 ℃。

1.2 粪便微生物测序

对鸡、鸭和鹅所有粪便微生物基因组进行测序，并通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时使用紫外分光光度计对DNA进行定量。添加样本特异性Barcode序列后，采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶对rRNA基因V4可变区进行PCR扩增。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行切胶回收，采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒进行回收。回收的片段采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，并在以Illumina MiSeq测序为例。具体测序步骤参照文献[9]。

1.3 粪便微生物多样性分析

数据下机后按文献[10]中流程进行过滤，使用QIIME软件过滤后的数据按97%的序列相似度进行归并和OTU划分，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列[11]，根据OTU的数目构建各样本中丰度的矩阵文件。随后利用QIIME软件（默认参数）通过将OTU代表序列与对应数据库[12]（Greengenes、Silva、UNITE）的模板序列相比对，获取每个OTU所对应的分类学信息。

样品均一化处理后（OTU丰度矩阵中的所有样本在90%的最低测序深度水平统一进行随机重抽样），使用QIIME软件分别对每个样本计算α多样性（Chao1指数、ACE指数、Simpson指数和Shannon-Wiener指数）。PCA分析通过线性变换，将原始的高维数据（如菌群OTU丰度矩阵）通过线性变换组合，投影到维度较低的空间坐标系（即主成分）中，从而达到降维、简化数据结构的目的，展现样本的自然分布[13]。PCA分析能够从原始数据中提取样本间最主要的差异特征，通过对PCA分析得到的前二维或三维数据作图，可得出群落样本的主要分布特征，从而量化样本间的差异和相似度。

1.4 差异菌种功能注释

利用PICRUSt软件对上述差异的菌属进行预测分析[14]。根据已测微生物基因组的16S rRNA基因全长序列，推断它们共同祖先的基因功能谱;对Greengenes 16S rRNA基因全长序列数据库中其他未测物种的基因功能谱进行推断，构建古菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱;将测序得到的16S rRNA基因序列数据与Greengenes数据库比对，寻找每一条测序序列的“参考序列最近邻居”，并归为参考OTU;根据“参考序列最近邻居”的rRNA基因拷贝数，对获得的OTU丰度矩阵进行校正;最后，将菌群组成数据“映射”到已知的基因功能谱数据库中，实现对菌群代谢功能的预测。

2 结果与分析

2.1 序列统计和物种注释结果

對鸡、鸭和鹅共86份粪便样品微生物的16S rDNA的V4区进行了测序，分别在母鸡、公鸡、母鸭、公鸭、母鹅和公鹅群体中分别发现445 998、435 385、377 744、531 451、489 023和357 468个OTU序列。研究结果表明，不同性别的鸡、鸭和鹅群体中共有该物种大多数的粪便微生物，但雌性群体中都发现更多种类的OTU序列（图1）。

2.2 多样性分析

利用α和β多样性指数研究性别对鸡、鸭和鹅粪便微生物多样性和群落组成进行研究。进一步利用Chao1指数和Shannon-Wiener指数估算鸡、鸭和鹅粪便微生物的α多样性，发现在母鸡、母鸭群体粪便中的微生物多样性均极显著高于公鸡和公鸭，但母鹅和公鹅粪便微生物多样性差异不显著（图2 A～C）。β多样性分析表明，鸡、鸭和鹅肠道的微生物群落有明显区别（图2 D～F）。综上所述，性别对鸡和鸭粪便微生物多样性有显著影响，对鸡、鸭、鹅粪便微生物的群落组成有明显影响。

2.3 性别对肠道微生物丰度及功能的影响

在门和属水平上，同一物种的不同性别家禽群体粪便肠道微生物有显著差异。研究表明，不同性别鸡群体的粪便微生物11个门50个属丰度有显著或极显著差异（P<0.05或P<0.01）;母鸭和公鸭群体粪便肠道微生物中有10个门78个属的微生物丰度有显著或极显著差异（P<0.05或P<0.01）;不同性别的鹅群体中粪便微生物有3个门24个属的肠道微生物丰度差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）（图3 A～C）。对上述鸡、鸭和鹅不同性别间的肠道微生物进行基因功能注释，结果表明性别对鸡、鸭和鹅粪便的功能有一定影响，特别是能量代谢、脂类代谢、氨基酸代谢和碳水化合物代谢等都有显著或极显著影响（图3 D～F）。

3 讨论

该研究发现性别对鸡和鸭肠道微生物群落多样性、微生物丰度及功能均有显著或极显著影响（P<0.05或P<0.01）。哺乳动物的相关研究表明，性别对肠道微生物的群落、组成和多样性均有显著影响[15]。该研究发现，鹅粪便微生物β多样性在不同性别间没有极显著差异，因此性别对肠道微生物的影响因性别而异。

哺乳动物的相关研究表明，肠道微生物的群落组成和多样性受到性激素的调控，并参与宿主免疫疾病和代谢等过程[16]。该研究发现，在门和属水平的优势菌群在同一物种的不同性别间是一致的，但菌群的丰度具有一定的偏好性，在属水平上鸡有大量的菌属丰度显著差异，有大量的属参与到碳水化合物消化生成短链脂肪酸（shortchain fatty acid，SCFA）的过程中，例如拟杆菌属（Bacteroides）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、梭杆菌属（Fusobacterium）、巨球型菌属（Megasphaera）、消化球菌属（Peptococcus）和链球菌属（Streptococcus）[17]，SCFA主要来自大肠内碳水化合物的发酵和蛋白质降解，肠道菌群通过产生SCFA对人体多个器官和代谢产生影响。SCFA对宿主有重要的生理功能，如调节肠道菌群、维持体液和电解质的平衡、为宿主提供能量、促进消化道细胞生长、诱导细胞分化、影响宿主消化道组织基因表达等重要作用[18]。上述研究结果表明不同性别家禽分泌的性激素不同，会影响肠道菌群以及粪便微生物的组成和丰度，并最终影响肠道终产物SCFA，进而影响宿主的健康。进一步研究发现，粪便微生物的差异功能注释也表明鸡、鸭和鹅肠道微生物功能在代谢和免疫等方面有显著差异。前期研究结果表明宿主和微生物共同作用消化碳水化合物和纤维素饲料食物[19]。

4 結论

性别对鸡、鸭的粪便微生物的多样性有显著或极显著影响（P<0.05或P<0.01），在属水平上发现大量的差异菌群的丰度有显著或极显著差异（P<0.05或P<0.01），进而影响到肠道微生物的功能。

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