番茄DNA甲基转移酶SlDNMT2基因RNAi表达载体的构建

张玉 汪宏涛 刘嘉荔

摘要 DNA甲基化是发生在基因5′端5′-CpG-3′胞嘧啶上的DNA共价修饰作用，可调节基因转录，与植物的生长、发育、成熟、衰老有着密切关系。DNMT2是首先从拟南芥中发现的DNA甲基转移酶。该研究通过NCBI序列比对获得番茄中DNMT2的同源基因SlDNMT2的编码区序列;通过Primer5设计引物，PCR技术扩增获得SlDNMT2基因高度特异性序列（长度约500 bp）;利用一系列分子生物学试验研究方法最终成功构建SlDNMT2 RNAi表达载体，并命名为pBI121-35S∷siRNA1-siRNA2。该RNAi表达载体的构建为进一步探究SlDNMT2基因在植物生长发育过程中的功能奠定了一定的理论基础并提供了一条高效、迅速的载体构建途径。

关键词 番茄;DNA甲基化;SlDNMT2;RNAi;载体构建

中图分类号 Q5-33 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0097-04

Abstract DNA methylation is a covalent modification of DNA that occurs at the 5′CpG3′ cytosine at the 5′ end of the gene，it regulates gene transcription and is closely related to plant growth， development， maturation and aging.DNMT2 is a key enzyme in DNA methylation which was found in Arabidopsis. In this study， firstly， the sequence of the coding region of SlDNMT2 was obtained by NCBI sequence alignment. And then the highly specific sequences of SlDNMT2 gene were acquired by polymerase chain reaction， and the primers were designed by Primer 5. Finally， taking advantage of a series of molecular biological experiment study methods，the SlDNMT2 RNAi expression vector was constructed successfully， and named PBI12135S∷siRNA1siRNA2. The construction of the RNAi expression vector not only laid the theoretical foundation for further exploring the SlDNMT2 genes function in plant growth and development stage but also provided an efficient and rapidly way of vector construction.

Key words Tomato;DNA methylation;SlDNMT2;RNAi;Construction of vector

番茄（Solanum lycopersicum）属茄科番茄属植物，是一种草本植物[1]，其最早发源于南美洲，17世纪传入亚洲。直至18世纪，番茄开始被作为食用植物栽培，此外番茄还具有一定药用价值[2]。至今，番茄被广泛种植于世界各地，具有重要研究意义。DNMT（DNA methyltransferase，DNMTs）是植株DNA甲基化过程中重要的甲基转移酶。真核生物中有3种DNA甲基转移酶，分别命名为DNMT1、DNMT2、DNMT3（DNMT3a和DNMT3b）[3]。DNMT1是一种维持DNA甲基化稳定性的酶;DNMT2是植物中特有的一种甲基转移酶，其通过与DNA结构特异位点结合而发挥特定作用，但具体机制研究尚少;DNMT3a和DNMT3b在DNA甲基化过程中发挥重要作用，可使去甲基化的胞嘧啶位点重新发生甲基化过程[4]。DNA甲基化是一种常见的DNA共价修饰作用，生物体在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）为辅酶，将甲基转移到特定的碱基上[5]。这种共价修饰通常发生在基因5′端5′—CpG—3′胞嘧啶上。DNA甲基化修饰可以调节基因转录，与植物的生长、发育、成熟、衰老有着密切关系[6]。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由于双链RNA导致的基因沉默现象。RNA沉默是一种通过形成双链RNA，特異性剔除或关闭目的基因表达的技术[7-9]。RNA干扰技术在进化上具有保守性，该技术将与目的基因mRNA序列同源互补的双链RNA（double strand RNA，dsRNA）转入植物细胞，植物细胞与dsRNA迅速发生应答反应，在核酸内切酶作用下，将dsRNA切割成许多特定的小干扰RNA序列（small interfering RNA，siRNA）[10]。在RNA解旋酶的作用下，siRNA发生解链作用，反义siRNA与核酸内切酶、核酸外切酶、RNA解旋酶结合，进一步形成RNA沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）[11]。RISC可与外源性mRNA同源序列发生特异性结合作用，对mRNA进行切割，而后降解断裂的mRNA。此外，在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下，siRNA还可以结合植物体内靶RNA，形成更多新的dsRNA，新dsRNA由核酸内切酶切割，进一步产生许多次级siRNA[12-14]，从而使RNA干扰的作用逐级放大，以期达到完全降解靶mRNA的效果，最终产生相应的功能表型缺失。

该研究通过NCBI网站Blast获得番茄植株DNMT2基因编码序列（coding sequence，CDS），通过序列保守性分析获得目的基因的高度特异性序列，PCR扩增该高度特异性序列。利用限制性内切酶切割pSK载体和特异性序列片段，经转化，阳性鉴定以及关键性发夹结构验证，最终获得番茄植株DNMT2基因RNAi表达载体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。

番茄植株是由实验室繁殖保存的来自美国康奈大学植物研究所的野生型番茄（Solanum lycopersicum Mill.cv.Ailsa Craig）。

1.1.2 菌株和质粒。

大肠杆菌（Escheriachia coli）DH5α、根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHAl05、植物表达载体pBI121、PSK均保存于实验室-80 ℃冰箱。

1.1.3 试剂。

限制性内切酶、Taq酶、高保真Pfu DNA polymerase、T4 DNA Ligase、Trizol（购自Invitrogen公司）、反转录试剂盒（购自TOYOBO公司）。胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒（购自Omega公司），引物由上海生工技术有限公司合成，测序由金唯智技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 植物总RNA提取。

利用试剂盒和Trizol试剂法提取番茄植物总RNA。操作过程：①取样，每100 mg组织中加入1 mL TP1溶液。②涡旋振荡，4 ℃离心，12 000 r/min，5 min。③取上清，加入等体积TPII溶液，颠倒混匀;加入1/4体积氯仿，颠倒混匀，室温静置5 min。④4 ℃离心，12 000 r/min，5 min，取上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min。⑤4 ℃离心，12 000 r/min，10 min，1 mL 75%乙醇清洗2次。⑥通风橱干燥处理后加入30～40 μL RNA溶解沉淀，后通过琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA质量，最后将样品保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.2 mRNA反转录。

利用反转录试剂盒对提取的mRNA反转录获得番茄植株cDNA。操作步骤：在20 μL体系中加入如下试剂：①mRNA X μL。②Accurt Reaction Mix（4X）2 μL。③Nudease-Free H2O（8-X） μL。④42 ℃静置2 min。⑤依次加入：Accurt Reaction stopper（5X）2 μL，5XAu-In-Due-RT-Master Mix 4 μL，Nudease-Free H2O 6 μL。反转录PCR反应程序为25 ℃ 10 min;42 ℃ 50 min;85 ℃ 5 min。⑥储存于-20 ℃备用。

1.2.3 引物设计和PCR扩增。

利用Primer 5软件设计引物，表1为该研究中所需主要引物。利用PCR技术，扩增得到SlDNMT2基因。SlDNMT2目的基因PCR扩增程序为95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s;引物温度（℃） 30 s;72 ℃ T（依据片段长度设定时间，min）;72 ℃ 10 min;12 ℃ 60 min。SlDNMT2基因特异性序列PCR扩增程序为94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s;引物温度（℃） 30 s;72 ℃ T（依据片段长度设定时间，min）;72 ℃ 10 min;12 ℃ 60 min。

1.2.4 番茄植株SlDNMT2基因RNAi表达载体的构建。

利用限制性内切酶处理pSK-siRNA1-siRNA2阳性菌重组质粒和pBI121质粒，经Omega公司胶回收试剂盒回收siRNA1-siRNA2高度特异性片段，T4 DNA连接酶4 ℃过夜连接，转化DH5α大肠杆菌感受态，阳性菌鉴定，最终得到番茄植株SlDNMT2基因RNAi表达载体，并将该载体重新命名为pBI121-35S∷siRNA1-siRNA2。载体构建流程见图1。

2 结果与分析

2.1 目的基因siRNA序列克隆及检测

2.1.1 SlDNMT2基因生物信息学分析。

通过NCBI网站Blast获得番茄DNMT2基因的编码区，其CDS全长为1 146 bp，共编码381个氨基酸。利用Trizol试剂法提取番茄植物总RNA，质量检测结果如图2所示。将SlDNMT2基因氨基酸序列与拟南芥AtDNMT2进行同源性比对分析，结果显示番茄SlDNMT2和拟南芥AtDNMT2的同源性达62.05%（图3）。并选取SlDNMT2基因起始密码子（ATG）至终止密码子（TGA）的编码区，利用SGN-VIGS网站，在Solanum_lycopersicum_ITAG _v2.40资料库中筛选，最终获得大小约500 bp的SlDNMT2基因高度特异性序列，并命名为小干扰RNA序列（siRNA）。

2.1.2 SlDNMT2基因特异性片段克隆。

以LeDNMT2-F和LeDNMT2-R为引物PCR扩增获得SlDNMT2目的基因片段。而后将SlDNMT2目的基因的PCR产物作为模板，以LeDNMTRi-F1、LeDNMTRi-R1、LeDNMTRi-F2、LeDNMTRi-R2为引物，利用PCR技术获得SlDNMT2的高度特异性序列（siRNA），PCR结果如图4所示。

2.2 阳性菌鉴定

2.2.1 siRNA1特异性序列阳性鉴定。

限制性内切酶Xho I、Hind Ⅲ酶切pSK载体和特异性序列1（siRNA1），T4 DNA Ligase 4 ℃过夜连接，转化DH5α大肠杆菌感受态，菌落PCR阳性鉴定。鉴定结果如图5所示，并获得1号阳性菌质粒用Xho I、Hind Ⅲ酶切获得siRNA1片段，在琼脂糖凝膠电泳下检测，结果如图6所示。泳道1内可以观察到一条大小约500 bp的特异性条带，送金唯智技术有限公司测序，经DNAMAN软件比对，测序结果正确。

2.2.2 siRNA2特異性序列阳性鉴定。

限制性内切酶Sac I、EcoR I酶切上述1号阳性菌质粒和特异性序列2（siRNA2），T4 DNA Ligase 4 ℃过夜连接，转化DH5α大肠杆菌感受态，经碱裂解法质粒快提阳性鉴定，琼脂糖凝胶电泳分析结果如图7所示，获得16号阳性菌质粒。分别用Sac I、EcoR I限制性内切酶酶切以及Xho I、EcoR I限制性内切酶酶切获得siRNA2片段（泳道1）及siRNA1-siRNA2片段（泳道2），琼脂糖电泳检测结果如图8所示，送金唯智技术有限公司测序，经DNAMAN软件比对，测序结果正确。

2.3 发夹结构的验证

限制性内切酶Xho I、EcoR I酶切上述16号阳性菌质粒，胶回收试剂盒回收siRNA1、siRNA2特异性片段，利用纯化试剂盒纯化后，进行发夹结构验证。经95 ℃热处理5 min后，分别自然退火（22 ℃）和冰上退火（4 ℃）30 min，在0.8%琼脂糖凝胶电泳下检测发夹结构的正确性，检测结果如图9所示。不同处理条件下，2个泳道内均能检测到特异性条带，且条带大小正确。

2.4 DNA甲基化转移酶SlDNMT2基因RNAi表达载体正确性检测

限制性内切酶Xho I、EcoR I酶切pBI121-siRNA1-siRNA2阳性菌质粒，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带的显色位置，以确定SlDNMT2基因RNAi表达载体构建的正确性，酶切后电泳结果如图10所示，4个阳性重组质粒经酶切后均能获得大小约1 200 bp的特异性条带。

3 结论与讨论

3.1 RNA干扰技术中特异性序列的选择

在构建SlDNMT2RNAi表达载体的过程中关键是特异性序列的选择，该研究通过NCBI网站序列比对作用，选择番茄植株编码区内高度特异性序列（约500 bp）设计引物，进而添加酶切位点，最终通过PCR技术扩增获得了SlDNMT2基因高度特异性序列。

3.2 RNAi表达载体构建中阳性鉴定

利用RNA沉默技术构建RNAi表达载体。在此过程中，发夹结构的鉴定是构建 pBI12135S∷siRNA1-siRNA2表达载体是否成功的关键。

根据重组质粒pBI12135S∷siRNA1-siRNA2与空载pBI121载体质粒分子量大小不同，其在1%琼脂糖凝胶中的迁移速率不同，通过质粒快提试验鉴定阳性菌;利用限制性内切酶酶切，胶回收，不同退火温度处理后，在琼脂糖凝胶电泳下检测发夹结构，根据DNA条带的位置验证发夹结构正确性，最终，成功构建植物SlDNMT2基因RNAi表达载体。

3.3 RNA干扰技术的意义与前景

RNA沉默技术是分析基因功能的有效途径之一。通过RNA干扰能特异性阻断目的基因的表达，获得缺失特定功能的RNAi突变体，进而对目的基因的功能进行分析[15]。RNAi技术为分析目的基因的功能提供了一种快速、高效的途径。

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