酒糟为基质提取凝血质的白地霉培养条件的优化

田小海，崔洪艳，王 莘

(长春医学高等专科学校，吉林长春 130031)



酒糟为基质提取凝血质的白地霉培养条件的优化

田小海，崔洪艳，王 莘

(长春医学高等专科学校，吉林长春 130031)

摘要[目的]优化从提取凝血质的白地霉培养的酒糟副产物利用的最佳培养基。[方法]先通过正交试验及单因素试验确定凝血质的最大提取量，探讨利用酒糟为基质培养白地霉的最佳培养基配比，即确定蛋白饲料水、DDGS水、废糖及酵母泥的最佳配比。[结果]4种营养成分的最佳配比为：蛋白饲料水20 mL、DDGS水120 mL、废糖1 g、酵母泥1.6 g。在以上条件下培养获得白地霉的干菌量为1.402 g，获得粗品的凝血质含量为2.3%。[结论]通过该试验的研究降低了培养白地霉的培养成本，提高了燃料乙醇发酵副产物及废糖的利用率，增加了废弃物的附加值，并开发了凝血质提取和获得的途径。

关键词凝血质；白地霉；酒糟；培养条件；优化

凝血系统是机体发挥内源性或外源性凝血途径的物质基础，凝血物质一般又分为经典凝血因子和激肽2个系统[1]。凝血质属于经典凝血因子中的凝血因子Ⅲ，当凝血因子Ⅲ与其受体Ⅶa结合后，可通过启动外源性凝血途径而发挥凝血作用[2]。

凝血质的来源较为广泛，如中药、微生物、动物等。一些中药中含有凝血质，但其含量不高，且通过分离提取获得量少，此外中药的来源也限制了凝血质的提取。动物源的凝血质从种属关系的角度来看属于较为优质的凝血质，但动物体内凝血质含量少，且通过实验动物途径获取的凝血质无法大规模生产。真菌中半知菌纲的真菌含量较为丰富，如酵母菌和白地霉中凝血质含量丰富，且此类真菌容易扩大培养，其分离与提取相对容易，因此微生物是获得凝血质的理想来源。

通过扩大培养获得大量真菌，在培养过程中降低培养真菌的消耗，可以通过利用一些废弃物来完成，如通过燃料乙醇发酵副产物和糖厂废糖的利用来降低培养基的消耗。笔者通过正交试验和单因素试验确定凝血质的最大提取量，探讨利用酒糟为基质培养白地霉的最佳培养基配比。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验仪器与耗材。试验仪器有摇床、多循环水式真空泵、干燥箱、恒温磁力搅拌器、TDL-5离心机、751分光光度计和PHS-3型酸度计、天平、冰箱；试验耗材有200目筛网、布氏漏斗、抽滤瓶、比色管。

1.1.2试验材料。DDGS水和蛋白饲料水，由乾安县酒精厂提供；废糖和废酵母，由糖厂和酵母厂家提供；白地霉菌种，购自于中国科学院微生物研究所。

1.1.3试剂。硫酸铵、硫酸镁、无水硫酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂(食品级)、无水乙醇、95%乙醇、乙醚和丙酮，均为分析纯。

1.2方法

1.2.1斜面培养。采用马铃薯培养基(PDA)对白地霉菌种进行活化，培养条件为28～30 ℃，培养3 d[3]。

1.2.2液体培养[4]。酵母膏2.0 g，葡萄糖3.0 g，磷酸二氢钠1.5 g，硫酸铵1.5 g，硫酸镁0.3 g。121 ℃下灭菌20 min，接种后摇床温度控制于28～30 ℃，摇瓶转速为110 r/min，摇床培养2 d[5]。

1.2.3特殊培养基培养[6]。在培养基中以DDGS水、蛋白饲料水、废糖和废酵母泥为基质进行培养，通过4因素3水平L9(34)的正交试验确定最佳培养基配比。正交试验的因素与水平如表1所示。

表1白地霉培养的正交试验因素与水平

Table 1Factors and levels of orthogonal test for cultivation ofGeotrichumcandidum

水平Level因素Factor蛋白饲料水Proteinfeedwater(A)∥mLDDGS水DDGSwater(B)∥mL废糖Wastesugar(C)∥g废酵母泥Yeastmud(D)∥g120401.00.8240802.01.23601203.01.6

1.2.4生长曲线的绘制[7]。分别对生长1～12 d的白地霉菌体的干菌量进行测定，从培养24 h后开始，每间隔24 h收集1次菌体，由于离心效果差，采用静置沉降的方法收集菌体[8]，测定前使用200目筛网对发酵液进行过滤，对过滤到的菌体进行烘干处理(50 ℃以下，防止蛋白变性)，烘干后进行称重。试验重复3次，取平均值。以发酵天数为横坐标，以干菌体重为纵坐标，绘制曲线，即为生长曲线。

1.2.5凝血质粗品的提取[9]。用一定浓度的乙醇对白地霉(干菌体)进行浸提(有温度要求)，获得提取液；提取液经过浓缩(有温度要求)，获得膏状物；膏状物经无水硫酸钠脱水后，再用乙醚提取，获得乙醚提取液；对乙醚提取液进行浓缩，获得浓缩物；浓缩物经丙酮沉淀后，获得凝血质粗品。

2结果与分析

2.1白地霉的生长曲线从图1可以看出，白地霉的平均干菌重随着发酵时间的延长而逐渐增加，第9天达到最大值。据报道，白地霉培养第8～10天是凝血质提取的最佳时间[10]，与该研究结果相一致。

2.2白地霉培养的正交试验结果由表2可知，各影响因素的最佳水平组合为A1B3C1D3，即蛋白饲料水20 mL、DDGS水120 mL、废糖1.0 g、废酵母泥1.6 g。各影响因素对白地霉培养的影响从大到小依次为C、A、D、B。其中，废糖是最大的影响因素，是白地霉生长过程中最主要的碳源，也是能量来源；蛋白饲料水为第2影响因素，是白地霉生长过程中氮的来源。通过正交试验结果可知，以4种培养基成分的最佳组合再次培养白地霉，获得白地霉干菌量为1.402 g。

图1　白地霉的生长曲线Fig.1　Growth curve of G. candidum

表2　白地霉培养的正交试验结果分析

2.3凝血质粗品提取量从图2可以看出，凝血质粗品的提取量随发酵时间的延长而逐渐增加，在第9天达到最大值(0.046 g)，粗提取率达到2.3%。

图2　不同发酵时间白地霉凝血质粗品提取量的变化 Fig.2　Changes of crude thromboplastin extraction amount of G.candidum under different fermentation time

3结论

白地霉中的凝血质是白地霉在生长繁殖过程中的次级代谢产物，因此在获得此类代谢产物时大多是在经过初级培养阶段之后，与白地霉的生长曲线相吻合。当白地霉的培养获得最大干菌量时，提取所获得的粗品凝血质的提取量最大。

研究白地霉的最佳培养方案就是获得凝血质粗品的最佳方案。为降低白地霉培养的成本，同时增加燃料乙醇发酵副产物的利用以及废糖和废酵母的利用，DDGS水是酒精生产过程中的废水，当其含量超过120 mL时，由于其内毒性因素的作用会对微生物的生长起到抑制作用，因此将120 mL DDGS水设为最上限。

4种营养成分的最佳配比方案为：蛋白饲料水20 mL、DDGS水120 mL、废糖1 g、酵母泥1.6 g。在以上条件下培养

获得白地霉的干菌量为1.402 g，获得粗品凝血质含量为2.3%。通过该试验研究降低了培养白地霉的培养成本，提高了燃料乙醇发酵副产物及废糖的利用率，增加了废弃物的附加值，降低了凝血质的生产成本。

参考文献

[1] 韩邦志，谢金鲜.中药止血与凝血机制的研究进展[J].广西中医药，2009，32(2)：6-8.

[2] 刘诗音.酵母菌类发酵提取凝血质及凝血作用的研究[D].长春：吉林农业大学，2011：1-59.

[3] 武汉大学，复旦大学.微生物学[M].2版.北京：高等教育出版社，1987：88-91.

[4] 张纪中.微生物分类学[M].上海：复旦大学出版社，1990：329-330.

[5] 中国科学院微生物研究所.常用与常见真菌[M].北京：科学出版社，1973：67-70.

[6] 杨廉婉，张树政.白地霉在液体培养基中连续传代所引起的形态变化[J].微生物学报，1965，11(2)：303-304.

[7] 钱铭镰.发酵工程最优化控制[M].南京：南京科学技术出版社，1998：150-153.

[8] ZIVELIN A，BAUDUER F，DUCOUT L，et al.Factor XI deficiency in French Basques is caused predominantly by an ancestral Cys38Arg mutation in the factor XI gene[J].Blood，2002，99(7)：2448.

[9] WANG W，WANG Y J，KELNNER D N.Coagulation factor VIII：Structure and stability[J].International journal of pharmaceutics，2003，259：1-15.

[10] SOLHEIM B G，FLESLAND O，BROSSTAD F，et al.Improved preservation of coagulation factors after pre-storage leukocyte depletion of whole blood[J].Transfusion and apheresis science，2003，29：133-139.

基金项目吉林省教育厅科学技术研究项目[吉教科验字(2009)141号]。

作者简介田小海(1980- )，男，吉林乾安人，讲师，硕士，从事微生物发酵、生物化学、医学微生物学与免疫学、生命教育的研究和教学。

收稿日期2016-03-26

中图分类号S 182

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)13-012-02

Optimization of Culture Conditions for the Extraction of Thromboplastin fromGeotrichumcandidumwith Lees as the Matrix

TIAN Xiao-hai, CUI Hong-yan, WANG Xin

(Changchun Medical College, Changchun, Jilin 130031)

Abstract[Objective] To optimize the culture condition for extraction of thromboplastin from Geotrichum candidum with lees as the matrix. [Method] Orthogonal test and single factor test were used to determine the maximum extraction amount of thromboplastin. The optimal culture medium composition was obtained with lees as the matrix, which was the ratios of protein feed water, DDGS water, waste sugar and yeast mud. [Result] The optimal formula of the four kinds of nutritional components were 20 mL protein feed water, 120 mL DDGS water, 1 g waste sugar and 1.6 g yeast mud. Under the above conditions, the amount of G. candidum was 1.402 g and the crude thromboplastin content was 2.3%. [Conclusion] This research reduces the cultivation cost of G. candidum, enhances the utilization rate of fuel ethanol fermentation by-products and waste sugar, increases the added value of waste, and develops the approaches for thromboplastin extraction and acquisition.

Key wordsThromboplastin; Geotrichum candidum; Lees; Culture condition; Optimization