甘薯茎尖脱毒培养技术研究

陈玉霞，邱建辉，张朝臣，刘作斌

(1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北武汉 430064；2.湖北省农业科学院粮食作物研究所，湖北武汉 430064)



甘薯茎尖脱毒培养技术研究

陈玉霞1，邱建辉1，张朝臣1，刘作斌2

(1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北武汉 430064；2.湖北省农业科学院粮食作物研究所，湖北武汉 430064)

摘要[目的]探讨利用甘薯茎尖分生组织获得脱毒苗以及脱毒苗鉴定的方法。[方法]以甘薯茎尖分生组织为培养对象，通过蔗糖及外源激素单因素试验研究甘薯茎尖脱毒培养技术。[结果]甘薯茎尖分生组织生长培养基为MS+6-BA 0.50 mg/L+ NAA 0.10 mg/L+蔗糖40 g/L+琼脂6.5 g/L，试管苗生根培养基为1/2MS+NAA 0.20 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.5 g/L。在茎尖生长培养基上对25个甘薯品种的茎尖分生组织进行培养，结果表明，8个品种的出苗率为50.0%～79.3%，16个品种的出苗率达80.0%以上，其中，5个品种的出苗率为100.0%。在生根培养基上，试管苗生根率达100%，根多而粗壮，茎叶生长旺盛。试管苗不用炼苗，可直接从培养瓶中移栽至细河沙中，成活率达100%。以巴西牵牛作为指示植物，采用靠接法对试管苗进行脱毒鉴定，脱毒率为79.1%。[结论]该研究为甘薯茎尖脱毒苗生产提供适宜的培养基配方和简便易行的脱毒苗鉴定技术。

关键词甘薯；茎尖；离体培养；脱毒；巴西牵牛

甘薯(Ipomeabatatas(L.)Lam)是一种分布广、产量高的块根作物，也是重要的粮食、饲料和工业原料[1]，在亚洲、非洲和拉丁美洲等热带地区广泛栽培。我国是甘薯主产国之一，2015年种植面积达343万 hm2，占世界甘薯种植面积的34%以上，鲜薯总产1.2×107t，占世界甘薯总产的66%，居世界首位[2-3]。湖北省也有近20万 hm2[4]。甘薯是利用块根和茎蔓繁殖的作物，因而易受病毒病的感染。由于病毒病的侵染危害，常导致甘薯品种退化、单产下降、品质变劣，不仅影响甘薯品种资源保存和新品种选育，更影响甘薯的商品性及其生产效益[5-7]。1978年，南非因甘薯病毒病减产50%，1979年，尼日利亚也因病毒病减产78%，我国南京、北京、四川和台湾的研究者也报道了甘薯病毒病严重感染情况，其减产最高达30%。近年来，湖北省农业科学院收集的甘薯品种资源中，约有50%被病毒病感染，个别品种已丧失结薯特性，严重影响了甘薯品种保纯和育种工作的正常进行[8]。

20世纪60年代初，国内外学者开始致力于甘薯病毒研究，对甘薯病毒的鉴定、诊断、分离、提纯及防治开展了一系列研究，以寻求防治甘薯病毒病的最佳途径[9-10]。目前，对植物病毒病尚无有效药物防治，应用茎尖脱毒培养技术是行之有效的方法之一[11-12]。该方法首先在大丽花和马铃薯上获得成功[13-14]，后来迅速应用于草莓、大蒜、石竹、兰花等经济植物上[15-17]。1960年，美国学者将此法应用于甘薯上，最先获得甘薯脱毒苗[18]。此后，日本、新西兰、哥伦比亚及我国台湾等地都研究证明了甘薯茎尖培养脱毒苗具有增产效果，并认为用此法脱毒复壮一个推广品种比新培育一个品种更加简便、迅速、经济。罗淑芳等[19]在改良MS培养基上培养0.3～0.6 mm大小的茎尖，获得了无病苗。江苏徐州甘薯研究中心组织国内多家单位与国际马铃薯中心合作，开展了甘薯病毒研究，并获得多个品种茎尖脱毒植株，增产效果明显[20]。湖北在20世纪80年代中期开始了植物组培快繁及茎尖脱毒培养技术研究，并在草莓、猕猴桃、葡萄、樱花、兰花等植物上得到广泛应用，获得了大批组培试管苗，取得了一定的经济效益和社会效益，但甘薯茎尖脱毒培养技术研究甚少。因此，开展甘薯茎尖脱毒培养技术研究对提高甘薯产量和品质、改善甘薯商品性、增加种植经济效益都具有重要意义。笔者探讨利用甘薯茎尖分生组织获得脱毒苗以及脱毒苗鉴定的方法，以期为甘薯茎尖脱毒苗生产提供适宜的培养基配方和简便易行的脱毒苗鉴定技术。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试品种。鄂薯1号、51-93、1030、1027等12个甘薯品种(或品系)由湖北省农业科学院甘薯组提供；南薯88、渝薯34、万薯90等13个品种分别采自四川及湖北恩施地区。

1.1.2主要设备。手提式不锈钢蒸汽灭菌锅、超净工作台、双目解剖镜、组织培养室、光照培养箱。

1.1.3试剂。MS 培养基、蔗糖、萘乙酸(NAA)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、 氯化汞或次氯酸钠、乙醇、0.1 mol/L NaOH与 0.1 mol/L HCl。

1.2方法

1.2.1样品的采集与消毒。茎尖培养前，取薯块新芽或大田生长蔓尖1～2 cm，剪去较大叶片，对芽尖进行消毒。首先用0.1%洗衣粉溶液漂洗10～15 min，倒去洗衣粉溶液，用纱布将芽尖包好，悬于水龙头下，小水冲洗20 min；再用滤纸吸干芽尖上的水分，用0.1%氯化汞(加吐温)消毒8～10 min，消毒时，不断振动容器，使氯化汞与芽尖充分接触；最后倒去氯化汞溶液，用无菌水冲洗3～4次，备用。

1.2.2茎尖的剥离。在接种室超净工作台上，利用双目解剖镜，将已消毒好的茎尖置于载玻片上，调节升降螺丝，使茎尖清晰可见。用解剖针轻轻剥去可见叶片，仅留2个叶原基，再用解剖刀小心切下带有2个叶原基的培养用茎尖，其大小为0.37～0.49 mm。

1.2.3茎尖生长培养基配方。以MS为基础培养基，分别添加不同浓度的蔗糖、NAA、6-BA等配制成不同培养基，接种已剥离的甘薯茎尖，置于光照培养箱中培养，保持温度25～28 ℃，光照时间12～16 h/d。在培养过程中，经常观察记载茎尖生长情况，及时剔除被污染材料，培养40 d后调查统计出苗率等各项指标。

1.2.4生根培养基配方。以1/2MS为基础培养基，分别添加不同浓度的NAA配制成不同培养基，接种具有4～5片真叶、生长基本一致的试管苗，每处理接种10瓶，每瓶接种5株。培养30 d后，进行抽样调查分析。

1.2.5试管苗移栽。将试管苗从培养室移至室外，移栽基质为细河沙或腐殖质土，栽后适量浇水，覆以塑料薄膜，做成拱棚形式。

1.2.6试管苗脱毒鉴定。采用靠接法，待盆栽的甘薯试管苗植株生长至一定高度后，将盆栽的巴西牵牛和盆栽的甘薯植株各一钵移到一起，在预备接合的部位，一株向上做一切口，一株向下做一切口，然后将两切口嵌在一起，用包装带包扎。待伤口愈合后，剪去甘薯植株的下部，使其上部与巴西牵牛共生在一起，观察并记录巴西牵牛新生叶片的生长情况。

2结果与分析

2.1甘薯茎尖生长培养基配方筛选

2.1.1不同蔗糖浓度的茎尖培养效果。以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+琼脂6.5 g/L为基础，分别添加30、40、50、60 g/L蔗糖，配制成4种培养基，在每种培养基上接种已剥离的鄂薯1号茎尖分生组织，培养40 d后进行调查，结果见表1。由表1可知，当蔗糖浓度为40 g/L时，出苗率75.00%，平均苗高0.90 cm，每株叶片数3.63片，最大叶1.8 cm×1.0 cm，此4项指标均优于其他处理。当蔗糖浓度超过40 g/L时，随着蔗糖浓度的增加，各项生物指标均呈下降趋势；当蔗糖浓度达60 g/L时，出苗率46.15%，平均苗高0.36 cm，每株叶片数2.14片，明显低于其他处理，而单株鲜重达0.31 g，高于其他处理，其茎尖呈紫红色，植株皱缩矮小。

表1　蔗糖浓度对甘薯茎尖培养的影响

2.1.2不同NAA含量的茎尖培养效果。以MS+6-BA 0.5 mg/L+蔗糖40 g/L+琼脂6.5 g/L为基础，分别加入0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L NAA，配制成4种培养基，在每种培养基上接种51-93茎尖分生组织，培养40 d后进行调查，结果见表2。由表2可知，当NAA浓度为0.10 mg/L时，出苗率、平均苗高和发根率均优于其他处理，幼苗生长快，叶片嫩绿，且有近50%植株长出3～5条嫩根，增加了营养吸收，促进了幼苗生长。当NAA浓度为0.20 mg/L时，出苗率只有25%，低于其他处理，大部分茎尖褐化未能成苗，已成苗的植株平均每株叶片数最高为3.50片。综合分析4个处理的各项生物指标，以NAA浓度0.10 mg/L为最佳。

2.1.3不同6-BA浓度的茎尖培养效果。以MS+NAA0.10 mg/L+蔗糖40 g/L+ 琼脂6.5 g/L为基础，分别添加0.10、0.25、0.50、1.00 mg/L 6-BA，配制成4种培养基，对51-93茎尖分生组织进行了接种、培养和观察，结果见表3。由表3可知，当6-BA浓度为0.50 mg/L时，其出苗率高达88.89%，平均苗高1.00 cm，每株叶片数达3.00片，叶片嫩绿，幼苗生长健壮，均优于其他处理。

表2　NAA浓度对甘薯茎尖培养的影响

表3　6-BA浓度对甘薯茎尖培养的影响

分析蔗糖、NAA、6-BA对甘薯茎尖培养效果的影响，获得了一种较优的茎尖生长培养基配方，即MS+ 6-BA 0.50 mg/L+ NAA 0.10 mg/L+蔗糖40 g/L+琼脂6.5 g/L。

2.2不同甘薯品种的茎尖培养效果采用上述优化的培养基，即MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 0.10 mg/L+蔗糖40 g/L+琼脂6.5 g/L，对25个甘薯品种(或品系)茎尖进行培养，调查其出苗率，结果见表4。

表4不同甘薯品种的茎尖培养效果

Table 4Effect of different sweet potato varieties stem tip culturing

品种(或品系)Varieties(orlines)接种数Inoculationnumber出苗数Seedingnumber出苗率Rateofseeding∥%10268181100.010675353100.03-59595100.0胜利百号VictoryNo.10088100.0崇阳北瓜苕Chongyang-Beig-uashao4141100.0南薯88Nanshu88555090.9鄂薯1号EshuNo.161954788.41053383386.851-9352445486.6河南苕Henanshao806986.310301221104685.71059342985.3116438833085.110586583.3二南苕Ernanshao564580.3徐薯18Xushu1822017680.01027584679.31071423276.2京山南瓜苕Jingshan-Nan-guashao8675.020-82674770.189-2410660.0万薯90Wanshu9011654.4西蒙1号XimengNo.1532750.967-1216850.0渝薯34Yushu3453713.2

由表4可知，1026、1067、3-5、胜利百号、崇阳北瓜苕5个品种茎尖培养出苗率达100.0%，南薯88、鄂薯1号、河南苕、徐薯18等11个品种茎尖培养出苗率达80.0%～90.9%，1027、京南瓜苕、西蒙1号等8个品种的出苗率为50.0%～79.3%，渝薯34出苗率最低，仅13.2%。

2.3甘薯试管苗生根培养基配方以1/2MS为基础培养基，分别添加0.10、0.15、0.20、0.25 mg/L NAA，配制成4种培养基，接种鄂薯1号试管苗，接种的幼苗具有4～5片真叶，生长基本一致，每处理接种10瓶，每瓶接种5苗。接种后7 d幼苗基部膨大并有白色根尖突起，12 d后4种生根培养基上的幼苗全部长出嫩根。特别是当NAA浓度为0.20 mg/L时，幼苗生长良好，表现为苗高适度，叶片肥厚呈淡绿色，平均每株根数达8.5条，根多而粗壮。因此，1/2MS+NAA 0.20 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.5 g/L可作为甘薯试管苗生根培养基。

2.4甘薯试管苗移栽甘薯试管苗在生根培养基上培养30 d后，不需炼苗，可直接将试管苗从培养瓶中夹出，用自来水洗去根部粘附的培养基，移栽至细河沙中，用洒水壶适量浇水，再覆盖塑料薄膜，做成拱棚形式。移栽后10 d 试管苗植株长出新根，30 d后试管苗成活率达100%，植株根系发达，茎叶生长健壮。试管苗最适移栽气温为10～22 ℃。试管苗移栽后，若塑料棚内温度达30 ℃以上，须开棚通风，以降低棚内温度，避免高温灼伤植株，傍晚温度下降时，再将薄膜盖严。待试管苗完全成活，可去除塑料薄膜，使其在自然条件下生长。

2.5甘薯试管苗的脱毒鉴定巴西牵牛对多种侵染甘薯的病毒(SPFMV、SPMMV、SPLV、SPVMV、SPCLV)敏感，且受病毒侵染后，叶片上易产生系统症状，如沿叶脉网状退绿、叶面皱缩、退绿斑及花叶等。

巴西牵牛和已移栽成活的甘薯试管苗均用盆栽，待植株生长至50～70 cm，将巴西牵牛和甘薯试管苗各一钵移到一起，进行靠接，待伤口愈合后，剪去甘薯植株的下部，使其上部与巴西牵牛共生。共靠接甘薯试管苗120株，成活110株，成活率91.7%。靠接后30 d，巴西牵牛叶片表现正常的87株，脱毒率达79.1%。

3结论与讨论

该研究以MS为基础培养基，进行蔗糖、NAA、6-BA的单因素茎尖培养试验，筛选出较优的培养基，即 MS+6-BA 0.50 mg/L+ NAA 0.10 mg/L+蔗糖40 g/L+琼脂6.5 g/L。用上述优化的培养基对25个甘薯品种的茎尖培养出苗率进行研究，结果表明，64%品种的出苗率在80.0%以上，其中有5个品种的出苗率达100.0%，32%品种的出苗率为50.0%～79.3%，渝薯34出苗率最低，仅为13.2%。个别品种出苗

率低，可能是由该品种的遗传特性所决定，亦或还需研制新的培养基配方。试管苗生根培养基配方为1/2MS+NAA0.20mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，生根率达100%，幼苗根多且粗壮，茎叶生长旺盛。

以细河沙为基质移栽试管苗，并覆以塑料薄膜，幼苗成活率达100.0%。试管苗不需炼苗，可直接从培养瓶移栽至细河沙中，这与谢玲玲等[21]先将试管苗在培养瓶中炼苗2～3d，再移栽至温室基质中炼苗10d以上有所不同。

将已经移栽成活的甘薯试管苗进行盆栽，当茎蔓生长至50～70cm，再与盆栽的巴西牵牛进行靠接，嫁接成活率达91.7%，试管苗脱毒率为79.1%。用靠接法检测甘薯茎尖分生组织试管苗的脱毒率，不仅简单易行、成本低，而且准确可靠[22]。

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作者简介陈玉霞(1963- )，女，湖北鄂州人，副研究员，从事植物组织培养研究。

收稿日期2016-03-25

中图分类号S 503.53

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)13-135-03

Research on the Virus-free Culture Technique of Sweet Potato Stem Apical Meristem

CHEN Yu-xia, QIU Jian-hui, ZHANG Chao-chen et al

(Institute for Agro-Products Processing and Nuclear-Agriculture Technology, Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan, Hubei 430064)

Abstract[Objective] The production of virus-free sweet potato plantlets by means of stem apical meristem-culturing and its identification method were researched. [Method] To explore the technique of sweet potato stem apical meristem culturing, the single factor experiment in the sucrose and exogenous hormone added in MS medium was conducted. [Result] The medium for plantlet regeneration was MS + BA 0.5 mg/L + NAA 0.10 mg/L + sucrose 40 g/L + agar 6.5 g/L and the medium of plantlet rooting in vitro was 1/2MS+NAA 0.20 mg/L sucrose 20 g/L+ agar 6.5 g/L. 25 sweet potato varieties were cultured in the growth medium and the results showed that the rate of plantlet of 8 varieties was 50%-79.3%; 16 varieties, more than 80.0% and 5 varieties, up to 100%. In the rooting medium, the rooting rate of plantlets was 100% and the root system was strong and with more roots. The stem and leaf of plantlets vigorously grew. The plantlets could be directly transplanted into fine sand and the survival rate of the plantlet reached 100%. The rate of virus-free in Brazil morning glory was 79.1% with the technical system. [Conclusion] The suitable media formulation for production of virus-free sweet potato plantlets and its simple identification technique are provided.

Key wordsSweet potato; Stem apical; Culture in vitro; Virus-free; Brazil morning glory