HPLC法检测光枝勾儿茶内芦丁和槲皮素方法的建立

武玉祥，王小平，王 虹，秦华军，万合峰，贾 强*

(1.贵州科学院贝科生物资源研究开发中心，贵州贵阳 550009；2.贵州省生物研究所，贵州贵阳 550009；3.黔东南民族职业技术学院，贵州凯里 556000)



HPLC法检测光枝勾儿茶内芦丁和槲皮素方法的建立

武玉祥1，2，王小平3，王 虹2，秦华军1，2，万合峰1，2，贾 强1，2*

(1.贵州科学院贝科生物资源研究开发中心，贵州贵阳 550009；2.贵州省生物研究所，贵州贵阳 550009；3.黔东南民族职业技术学院，贵州凯里 556000)

摘要[目的]建立一种同时测定光枝勾儿茶中芦丁和槲皮素的含量的方法。[方法]采用HPLC法对光枝勾儿茶内的芦丁和槲皮素进行测定，色谱柱为ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1 %磷酸水溶液，检测波长360 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃；进样量10 μL。[结果]芦丁和槲皮素分别在0.109～1.090和0.104～1.040 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。芦丁平均回收率为98.84%，RSD为2.34%；槲皮素平均回收率为99.65%，RSD为2.51%。[结论]该方法简便、准确、精密度高、重复性好，可用于该药材的质量检测。

关键词光枝勾儿茶；芦丁；槲皮素；HPLC法；含量

目前，市场上治疗猪、牛、羊腹泻的主要药物是抗生素类，抗生素使用后在动物体内存在残留和抗药性问题，食用后影响人体健康。中兽药能有效避免药物残留和抗药性的问题，成为目前研究的热点[1]，如止痢散，其主要成分是光枝勾儿茶[2]。光枝勾儿茶(BerchemiapolyphyllaWall.ex.Lawson)是鼠李科勾儿茶属的一个变种，具有清热利湿、止咳等功效[3]，同时可治疗猪、牛、羊的腹泻[4-8]。

中兽药进入市场前需对药物的质量标准进行检测，为此需对止痢散药效进行检测。研究发现，止痢散主要药效源于光之勾儿茶内的黄酮类化合物芦丁和槲皮素[9]，测定芦丁和槲皮素的主要方法有分光光度法和HPLC法[10-11]。检测光枝勾儿茶中芦丁和槲皮素报道较少且一般均分开检测这2种物质[12-13]，忽略了两者在一起的药效作用，对评价光之勾儿茶内芦丁和槲皮素的联合药效不够精确，该研究采用HPLC法同时测定光枝勾儿茶内芦丁和槲皮素的含量，以期为评价光枝勾儿茶药效提供依据。

1材料与方法

1.1仪器Agilent 1263LC色谱仪(美国Agilent公司)；SB2200型超声波清洗机(上海卓越仪器有限公司)；AE200电子天平(中国梅特勒托利多公司)；优普超纯水机(成都优普仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(天津泰斯特仪器公司)；98-1-B型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；SHB-循环水式多真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；旋转蒸发器RE-3000(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2试料光枝勾儿茶采自贵州省贵阳修文、安顺镇宁、兴义贞丰、安顺关岭、安顺紫云、广西桂林、四川成都、黔东南丹寨、毕节纳雍、铜仁德江等不同地区，每个地区均采集根、藤、叶。芦丁对照品购于中国药品生物制品检定所，批号10080-200707，含量90.5%；槲皮素对照品购于中国生物制品检定所，批号10081-200406，含量97.3%。乙腈为色谱纯；其他试剂为分析纯；水为去离子水。

1.3方法

1.3.1溶液的配置。

1.3.1.1对照品溶液的制备。精密称取真空干燥芦丁对照品10.9 mg，用甲醇使其充分溶解，定容至10 mL，得质量浓度为0.109 mg/mL，备用。精密称取真空干燥槲皮素对照品10.4 mg，用甲醇使其充分溶解，并定容至10 mL，得质量浓度为0.104 mg/mL，备用。

1.3.1.2供试品溶液的制备。准确称取光枝勾儿茶粉末10.00 mg，用100 mL甲醇回流提取3次，每次提取1 h，过滤，合并滤液，滤液挥发干燥，用甲醇定容至100 mL，再用0.45 μm滤膜过滤，滤液作为供试品备用。

1.3.2方法学考察。

1.3.2.1色谱条件及系统适应性试验。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-磷酸水溶液，流速1.0 mL/min，柱温28 ℃，进样量10 μL，检测波长360 nm。在选定条件下，芦丁、槲皮素色谱峰与其他杂质峰达到基线分离，分离度(R)>1.5，芦丁、槲皮素踏板数>3 000。

1.3.2.2标准曲线的绘制。

(1)芦丁标准曲线的绘制。精密吸取质量浓度为0.109 mg/mL的芦丁对照品供试液1、2、4、6、8、10 μL进样，按照“1.3.2.1”色谱条件进行测定，以峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。

(2)槲皮素标准曲线的绘制。精密吸取质量浓度为0.104 mg/mL的槲皮素对照品供试液1、2、4、6、8、10 μL进样，按照“1.3.2.1”色谱条件进行测定，以峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.3.2.3精密度试验。取对照品溶液10 μL，分别连续进样5次，每次10 μL，以峰面积计算精密度，要求RSD<3%。

1.3.2.4重复性试验。精密称取光枝勾儿茶药材6份样品，按“1.3.1.2”方法操作，每份进样5次，每次10 μL，要求芦丁、槲皮素的RSD<3%。

1.3.2.5稳定性试验。取对照品、供试品各1份，室温下分别放置0、2、4、12、24、48 h后，测定峰面积。

1.3.2.6加样回收率试验。根据线性范围设计芦丁和槲皮素含量高、中、低3种水平，精密吸取已测知芦丁和槲皮素含量的光枝勾儿茶药材适量，每个水平3份，再分别按要求精密加入一定量的对照品，按“1.3.1.2”方法操作，用HPLC方法测定，计算回收率。

1.3.3样品中芦丁、槲皮素含量的测定。过0.45 μm滤膜后，按照“1.3.2.1”色谱条件和“1.3.1.2”供试品溶液配制方法测定芦丁和槲皮素的含量。

2结果与分析

2.1方法学考察

2.1.1系统适应性试验。由图1可见，在6.105 min，芦丁对照品出现最大吸收峰，主峰尖锐且无杂峰；槲皮素对照品在19.375 min出现最大吸收峰，主峰尖锐无杂峰。样品中芦丁和槲皮素的最大吸收峰主峰尖锐无杂峰，最大吸收峰出现的时间分别在6.069和19.206 min，与对照品最大吸收峰时间十分接近。

图1　芦丁对照品(a)、槲皮素对照品(b)和安顺紫云样品(c)HPLC图谱Fig. 1　HPLC value of rutin(a), quercetin(b) and Anshun Ziyun sample(c)

2.1.2标准曲线的绘制。按照“1.3.2.1”方法操作，得到芦丁和槲皮素的回归曲线分别为Y=269.9X+9.689 9(r=0.999 5)、Y=818.71X(r=0.999 9)，表明芦丁和槲皮素的浓度分别在0.109～1.090、0.104～1.040 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.1.3精密度试验。按照“1.3.2.3”方法操作，得到芦丁和槲皮素RSD分别为0.32%、0.29%(n=5)，表明操作过程中仪器精密度良好。

2.1.4重复性试验。按照“1.3.2.4”方法操作，得到芦丁、槲皮素RSD分别为2.48%、2.94%，表明方法具有较好的重复性。

2.1.5稳定性试验。按照“1.3.2.5”方法，得到芦丁和槲皮素的峰面积RSD分别为1.86%、2.87%，表明样品供试液在48 h内稳定。

2.1.6加样回收率试验。由表1可见，芦丁平均回收率为98.84%，RSD值为2.34%，槲皮素平均回收率为99.65%，RSD值为2.51%，表明加样回收率均符合要求。

2.2样品中芦丁、槲皮素含量的测定分别对采集于我国不同地区的10个光之勾儿茶样品内的芦丁和槲皮素进行同时测定，结果发现(表2)，黔东南丹寨的光之勾儿茶内芦丁、槲皮素含量最高。

3讨论与结论

该试验在制备供试品溶液时分别采用50%、95%的乙醇、无水乙醇、甲醇作为溶剂，经过HPLC试验分析，得出甲醇溶解所得的供试品峰形、分离度均好。因此，选取甲醇为提取液。预试验分别采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈- 水、乙腈-0.1%磷酸为流动相系统，通过出峰数目、峰面积、分离度等的对比，选择最优的流动相为乙腈-0.1%磷酸，在此流动相系统时出峰的数目多，分离效果好，漂移现象弱，峰形好。在预试验过程中分别选用280、354、360 nm，其中芦丁最大吸收波长分别为280、360 nm，槲皮素吸收最大波长分别为254、360 nm，兼顾芦丁、槲皮素检测灵敏度，确定最佳检测波长为360 nm。芦丁和槲皮素在360 nm处有最大的紫外吸收值。

该研究采用HPLC法同时测定光枝勾儿茶内芦丁和槲皮素的含量，结果发现，芦丁和槲皮素分别在0.109～1.090和0.104～1.040 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；芦丁平均回收率为98.84%，RSD为2.34%；槲皮素平均回收率为99.65%，RSD为2.51%。该方法简便、准确、精密度高、重复性好，可用于该药材的质量检测，为光枝勾儿茶质量标准提供重要的方法依据。

表1　加样回收率试验结果

表2　样品中芦丁及槲皮素含量测定结果

参考文献

[1] 滕红丽，陈科力，陈士林.壮药铁包金及其药材商品的物种基础[J].中药材，2010(5)：675-677.

[2] 广西药用植物园.广西药用植物园药用植物名录[Z].2006:139-141.

[3] 湖北省中药资源普查办公室.中药资源名录[M].北京：科学出版社，1990:212.

[4] 陈德明.消炎止痢散[J].河南农业科学，1976(3):37.

[5] 措毛加.特效止痢散在仔猪腹泻预防中的应用[J].中国畜牧兽医文摘，2015(1):204.

[6] 路卫星.中药止痢散防治仔猪腹泻病的试验[J].黑龙江畜牧兽医，2015(6):111-112.

[7] 孟庆大.药典方剂止痢散的药效与毒理学研究[D].长春：吉林大学，2010.

[8] 杨娟，潘琪，魏东法，等.光枝勾儿茶化学成分研究(II)[J].中国药学杂志，2006(4):255-257.

[9] 杨娟，段文峰，彭英,等.光枝勾儿茶化学成分研究(Ⅰ)[J].中草药，2006(6)：836-837.

[10] 吴玉强，邓家刚，钟正,等.铁包金提取物镇痛作用的研究[J].时珍国医国药，2008，19(4):854-855.

[11] 金越，吕勇，韩国柱，等.槲皮素及异槲皮素、芦丁抗自由基活性的比较研究[J].中草药，2007(3)：408-4011.

[12] 尚永辉，李华，孙家娟，等.偏最小二乘-分光光度法同时测定芦丁与槲皮素的方法研究[J].分析测试学报，2011(4)：457-460.

[13] 滕红丽，郭力城，李鑫.光枝勾儿茶高效液相色谱指纹图谱研究[J].时珍国医国药，2011(5)：1233-1235.

基金项目贵州省科技厅重大专项[黔科合重大专项(2013)6041]。

作者简介武玉祥(1985- )，男，山东临沂人，研究实习员，硕士，从事微生物学与分子生物学研究。*通讯作者，研究员，博士，硕士生导师，从事生物资源开发与利用研究。

收稿日期2016-03-23

中图分类号R 284

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)13-164-03

Establishment of the Testing Method of Rutin and Quercetin inBerchemiapolyphyllaWall.ex.Lawson with HPLC

WU Yu-xiang1,2， WANG Xiao-ping3，WANG Hong2, JIA Qiang1,2*et al

(1.Academy of Sciences Beike Biological Resource Research and Development Center，Guiyang，Guizhou 550009；2.Guizhou Institute of Biology，Guiyang，Guizhou 550009；3.Qiandongnan National Vocational and Technical College, Kaili，Guizhou 556000)

Abstract[Objective] The determination method of rutin and quercetin in Berchemia polyphylla Wall was established at same time. [Method]The contain of rutin and quercetin in Berchemia polyphylla Wall was tested with HPLC method, in which, the column was ZORBAX SB-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm); the mobile phase of acetonitrile -0.1% phosphoric acid solution; the detection wavelength, 360 nm; the flow rate, 1.0 mL / min; the column temperature, 25 ℃ and the injection volume, 10 μL. [Result] There was good linear relationship between the content of rutin and quercetin and the value of testing peak area when the contain of rutin and quercetinin was in the range of 0.109～1.090 and 0.104-1.040 μg respectively. Average recovery ratio of rutin was 98.84% and RSD was 2.34%; average recovery ratio of quercetin was 99.65% and RSD 2.51%. [Conclusion] The method is simple, accurate, high precision and good repeatability that could be used in the measurement of the Chinese medicine quality.

Key wordsBerchemia polyphylla Wall；Rutin；Quercetin；HPLC；Content