小球藻生长及关键营养元素代谢规律的研究

纪旭艳 李荣贵 郭欣 黄青山

摘要[目的]探索小球藻生长过程中关键营养元素代谢的基本规律，优化小球藻大规模培养工艺。[方法]以新型、高效的平板气升环流式光生物反应器为模式反应器培养小球藻，定时检测均匀鼓泡流下小球藻的生长状况和培养液中氮、磷、钾、钙、镁、铁等关键营养元素的浓度。[结果]小球藻在264 h内的干重浓度接近线性增加趋势；铁元素在48 h后几乎消耗殆尽；氮和磷元素在168 h后降至较低水平；镁和钙元素在96 h降至較低水平后不再明显下降；钾元素虽然是小球藻生长的重要组成元素，但其浓度始终处于波动状态，变化并不显著。[结论]小球藻的元素代谢主要发生在168 h前，各种元素的代谢速率有显著差异；生长后期虽然大多数营养元素比较缺乏，但在持续光照和通入足够二氧化碳的条件下小球藻仍然可以继续生长一段时间。

关键词 二氧化碳；小球藻；元素代谢；平板气升环流式光生物反应器；均匀鼓泡流

中图分类号 S968.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）09-001-04

Abstract[Objective]The aim was to explore the basic law of key elements metabolism in the growth process of Chlorella vulgaris， and optimize the largesclae cultivation process.[Method]A new and highefficient rectangular airlift loop photobioreactor was employed to produce Chlorella vulgaris， and the concentration curves of the key elements in the culture including N， P， K， Ca， Mg and Fe were measured every day during the cultivation to investigate the metabolic laws under the bubbly flow condition.[Result]The results indicated that the concentration of biomass based on the dry weight increases nearly linearly. The concentration of iron was depleted within 48 hours； Nitrogen and phosphorus dropped to a very low concentration after 168 hours. The concentration of magnesium and calcium were no longer declining after 96 hours， while the concentration of potassium kept unchanged. Nitrogen， phosphorus， magnesium， calcium and iron were essential elements for the growth of Chlorella vulgaris， but potassium was not necessary to be kept with a high concentration.[Conclusion]Most of the key elements are depleted in 168 h， and different element consumption rates are obtained. Although the lack of nutrients at last， the Chlorella vulgaris keeps growing by adding gas with sufficient CO2 and keeping illumination continuously in a limited period.

Key words Carbon dioxide； Chlorella vulgaris； Element metabolism； Rectangular airlift loop photobioreactor； Bubbly flow

小球藻是一类水生单细胞微藻，生长迅速，易于养殖，具有含油率高、蛋白质含量丰富、可净化水质和空气等优点[1]，因此被广泛应用于污水净化[2-3]、生物燃料[4]、医药保健、饲料等领域[5]，可进行异养生长和自养生长。异养培养的小球藻虽然可以达到较高的生长密度[6-7]，但其缺点也较多，如成本过高、容易染菌等[8]。自养培养的小球藻虽然生长浓度较低，但通过改变光照、温度、培养液组分等条件[9-12]，也能达到较高的生物量浓度。随着小球藻的生长，培养液中的关键营养元素会被逐渐消耗掉，而这些元素对小球藻的生长有不同的生理作用。Gorain等[13]研究表明钙元素的缺乏和镁元素的增加，有助于小球藻脂质的积累。Griffiths等[14]和Chu等[15]研究也发现氮元素的缺乏虽然会降低小球藻的生长速率，但可以增加脂质的含量。Concas等[16]研究表明适量增加铁元素浓度对小球藻的生长速率和脂质含量均有增大的作用。Xu等[17]报道改变培养液中的碳氮元素比例可以影响磷元素的吸收，当碳氮比为6∶1时小球藻对磷元素的吸收率最高。总体而言，已有大量研究注重于部分营养元素对最终产物的调控，而关于关键营养元素代谢对小球藻生长的影响研究缺少全面、系统性的研究，而这是目前大幅度提高小球藻生物量产率的关键。

在实际的小球藻培养中，如果起初加入太多的营养元素，则会因为培养液盐度过高而抑制小球藻的生长；在生长过程中，随着培养液中关键营养元素的不断消耗，小球藻的生长会由于某些元素的缺乏而生长变缓。因此，总结出小球藻的关键营养元素代谢规律，以此来对培养液进行适时补充或改变，对于实现小球藻高密度培养、脂质和蛋白质的积累具有重要意义，也是最简单易行的办法。笔者在一种高效的平板气升环流式光生物反应器中培养小球藻[18]，探索小球藻生长过程中一些关键营养元素的代谢规律，旨在优化小球藻的培养工艺，从而提高其产量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂。硝酸钠、碳酸钠、氯化钙、七水硫酸镁、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钾、硼酸、五水硫酸铜、二水合钼酸钠、四水合氯化锰、七水硫酸锌、六水硝酸钴、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸亚铁、钼酸铵、六水氯化钴、过硫酸钾、氢氧化钠、硫酸亚铁铵、氯化铵、柠檬酸、柠檬酸铁铵、盐酸、刚果红、盐酸羟胺、冰乙酸、乙酸铵、邻菲啰啉、硫酸、钙指示剂、铬黑T、无水乙醇、25%氨水、抗坏血酸、酒石酸锑钾、四苯硼钠、酚酞、5%次氯酸钠溶液；2%二氧化碳和空气的混合气。

1.1.2 藻种。小球藻来自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。

1.1.3 培养基。试验使用2种培养基，小球藻藻种的培养使用BG11培养基[18]，扩大培养和平板气升环流式光生物反应器中的培养使用改良的培養基，其配方如下：1 g/L 硝酸钾、66.45 mg/L 氯化钙、237 mg/L磷酸二氢钾、30 mg/L七水硫酸亚铁、40 mg/L乙二胺四乙酸二钠、204 mg/L七水硫酸镁、1 mL/L重金属离子溶液。重金属离子溶液配方为：083 g/L 硼酸、0.95 g/L五水硫酸铜、0.17 g/L 钼酸铵、3.3 g/L 四水合氯化锰、2.7 g/L 七水硫酸锌、0.51 g/L六水氯化钴。

1.1.4 仪器与耗材。1 L锥形瓶培养；1 L的管式反应器；14 L的柱式反应器；45 L的平板气升环流式光生物反应器；36 W日光灯[18]。

1.2 方法

1.2.1 小球藻的培养。小球藻的培养过程包括藻种培养、扩大培养和在平板气升环流式光生物反应器内的培养。所有的试验装置均使用次氯酸钠浸泡杀菌，培养基在使用前均进行高温、高压灭菌处理。

①藻种培养。使用BG11培养基，使用1 L的锥形瓶，置于日光灯下培养，定期摇匀。

②小球藻的扩大培养。使用改良的培养基，使用1 L的管式反应器和14 L的柱式反应器，并持续通入含2%CO2的空气混合气，置于日光灯下培养。

③小球藻的最终培养在平板气升环流式光生物反应器中。使用改良的培养基，培养基浓度为基准使用量的2倍，并持续通入空气与纯CO2混合均匀曝气，空气流量为150 L/h，CO2流量为51 mL/min，培养时间约为264 h，每天取样1次，检测小球藻的生长状况和培养液中的钾、钙、镁、氮、磷、铁元素的浓度变化。

1.2.2 元素分析和小球藻生物量检测。小球藻的生物量采取抽滤、烘干、称重的办法进行检测，准备已称重、孔径0.44 μm的微孔滤膜，根据藻液浓度定量抽滤10～100 mL的藻液，并将留有小球藻的滤膜置于恒温干燥箱内24 h后称重，根据前后重量差来计算每次平行取样藻液的生物量干重浓度，然后取多次取样的均值作为平均浓度，将抽滤后的澄清溶液进行元素分析。钾元素浓度使用四苯硼酸钾重量法[19]测定，钙和镁元素浓度使用EDTA滴定法[20]测定，氮元素浓度采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法[21]测定，磷元素浓度采用钼酸铵分光光度法[22]测定，铁元素浓度使用邻菲啰啉分光光度法[23]测定。

2 结果与分析

2.1 小球藻的生物量变化

从图1可以看出，试验中控制小球藻的接种浓度约为0.2 g/L，经过264 h的培养，小球藻的干重的变化趋势近似线性增加。总体来看，前期增长速度略快，后期增长速度略微缓慢，小球藻的最终浓度在4.5 g/L左右，比初始浓度增加了大约22倍，生物量积累速率约为04 g/（L·d）。由于该试验使用的日光灯光强较弱，约为120 μmol/（m2·s），随着藻液浓度的增大，光穿透力仅有几毫米，光成为限制小球藻快速生长的主要因素。因此，试验中并未明显观察到小球藻的指数生长期，而是呈持续近似线性增长。

2.2 关键元素浓度的变化

从图2和图3可以看出，氮和磷2种元素的代谢规律基本相似，196 h以前2种元素的浓度都快速下降，而在196～264 h达到极低水平，小球藻无法继续摄取利用，因此其浓度基本不再变化，此时的氮浓度约为5.0 mg/L，而磷浓度约为15 mg/L，氮和磷的吸收率分别达到97%和83%以上。196 h后，虽然2种元素的浓度不再下降，在氮磷元素短缺的情况下，持续通入CO2补充碳源，生物量仍然在继续增加，小球藻仍然可以继续生长72 h以上。

从图4可以看出，培养液中的钾浓度并未呈现出下降的趋势，整体处于小幅波动的状态。这可能是由于钾元素只是小球藻摄取、排出来维持渗透压的一种元素，在小球藻的内外进行周期循环，但其并不是构成小球藻的重要元素。因此，在培养过程中不需要进行钾元素的额外补充。

从图5和图6可以看出，钙元素整体呈下降趋势，96 h下降到较低的浓度，96 h后仅有小幅度下降，最终浓度约为30 mg/L，此浓度大约为小球藻可以摄取与利用的临界值。镁元素的代谢规律与钙元素相似，前期浓度快速下降，大约在96 h后镁浓度处于波动状态，镁浓度几乎不变。据此推测，当镁浓度低于30 mg/L时，小球藻同样不能摄取与利用该元素。

从图7可以看出，与前几种元素相比，铁浓度的下降尤为明显和迅速。在前24 h铁浓度急速下降到约3 mg/L，48 h下降到1 mg/L以下，48 h后下降非常缓慢，由于铁浓度过低而无法继续被小球藻摄取利用，因此铁浓度基本不再变化，但小球藻的生长速率也未见明显降低。

2.3 試验干扰因素分析

对元素代谢规律的研究，试验使用的是间接测量培养液中剩余元素的浓度来分析小球藻对各种元素的吸收与利用规律，而元素可能会有其他一些损失途径（如生产沉淀、挥发等）。根据培养基配方可知，培养液中的氮源主要以硝酸根的形式存在，仅有不到0.1%的氮是以铵根形式存在，极少量的氮可能会以氨挥发和反硝化途径损耗。钾离子本身不会与其他离子生成沉淀，也不会挥发掉。钙、镁和亚铁离子的沉淀pH分别为9.5、10.5和7.6，而该试验中测得的初始pH为6.5左右，大约96 h后上升到76左右，最终pH不超过8.2，达不到钙镁离子沉淀的条件。96 h后虽然能达到亚铁离子沉淀的pH，但铁元素代谢主要发生在48 h前，96 h后并无明显变化，而且培养基中的亚铁离子与EDTA形成稳定的络合物，不易形成沉淀。因此，钙、镁和铁离子不会有沉淀损失。在小球藻干重测量时，理论上也不会掺杂这些元素的沉淀物对结果产生影响。

为了进一步验证上述结果，该试验设置了1个空白对照组：在1个1 L的大试管中，加入水和培养基，并持续通入CO2，8 h后取100 mL溶液进行抽滤、烘干测定，结果表明溶液中的不溶性物质仅有约15 mg/L，而小球藻1 d后干重就超过0.8 g/L，不溶物仅占小球藻干重的1%左右，对试验结果影响不大。培养液中溶解的钙、铁、镁、钾等矿物质元素浓度远大于沉淀物的浓度，而沉淀物的大部分又是水中原有的沙粒等物质，因此沉淀物中可能仅有极微量的部分是由培养液中的无机盐沉淀所致。此外，这些无机盐的沉淀作用也仅会发生在前期，并不会影响后期元素变化的趋势。因此，可以认为培养液中的营养元素的消耗绝大部分是被小球藻吸收利用。

3 讨论

3.1 小球藻的生物量

该试验使用高效的平板气升式环流式光生物反应器，小球藻的产量和产率要比一些常规的培养方式高很多。严佳琦等[24]研究表明光合自养的小球藻7 d产量达到0.92 g/L，仅达到该试验培养3 d产量的60%。Wang等[25]使用鼓泡塔光生物反应器培养小球藻，小球藻的生物量产率为31.55 mg/（L·d），仅达到该试验产率的8%左右。如果后期对营养元素进行适当补充，并且适量增加光照强度，该试验预期可以达到更高的生物量和产率。

3.2 关键元素浓度变化

（1）氮和磷元素的浓度下降较快，由于氮和磷元素都是影响小球藻生长的关键营养元素，也是污染环境、造成水华等现象的主要元素，而小球藻对氮和磷元素具有高去除率的特点，如果应用在污水处理方面，不仅能净化水源，还可以节约培养成本。吕本松等[8]研究表明氮元素和磷元素对促进小球藻生物量积累的协同作用与2种元素的配比有关，当小球藻培养液中的氮磷比为15∶1～16∶1时小球藻的生物量积累最高。该试验的初始氮磷比为2.65∶1，随着消耗，后期氮磷比为1∶3。因此，可以适当提高培养基初始浓度中的氮磷比，将更有利于小球藻的快速生长。

（2）钾元素浓度基本不变，其不被小球藻吸收利用，仅在细胞内外周期循环，可能与调节小球藻的渗透压有关。此外，钾元素可能还有维持酶的活性、调控基因表达等作用。

（3）钙、镁元素的代谢主要发生在前期，在96 h后2种元素的浓度降到约30 mg/L，后期由于钙、镁浓度低导致小球藻无法摄取与利用，因此钙、镁浓度几乎不再变化。已有研究表明，在小球藻的生长过程中减少钙元素的供应、数倍增加镁元素的供应，均有利于小球藻内脂质的积累[13]，缺镁胁迫下小球藻的脂质积累得到了提高，生长速率、光合活性和光合色素都有明显下降[26]。因此，在特定时期对钙和镁元素浓度进行调整，可以促进小球藻目标产物的提高。

（4）铁元素代谢速率尤为迅速，在48 h内初始浓度由10 mg/L降到1 mg/L以下，此后几乎不再下降，但并不影响小球藻生物量的继续增加。这是由于铁元素的浓度影响小球藻脂质的积累，补充足量的铁元素可以增加小球藻的产油率[16]，其对小球藻生长速率的影响却不大[27]。骆科柩[28]试验也表明铁浓度会影响到小球藻对磷元素的吸收，铁磷元素的比例则会影响到小球藻的生长速率，当铁磷比为0.7时小球藻可以达到较高的比生长速率。该试验中铁磷元素的初始比为0.12，铁磷元素比例较低。因此，在实际的营养元素补充时，除了适时、适量地添加营养元素以外，还应注意维持各元素之间的比例平衡，才能保证小球藻的高速生长和目标产物的积累。

4 结论

该试验中小球藻在264 h的生长过程中生物量干重接近线性增加，而关键营养元素的代谢规律各不相同。氮和磷元素的代谢发生在前168 h，钙和镁元素的代谢发生在前72 h，铁元素的代谢发生在前48 h，而钾元素浓度全程处于波动状态并未下降。在培养168 h后，培养液中的关键营养元素几乎耗尽，其浓度也不再下降。此时，若继续通入CO2，小球藻仍然可以在充足光照和CO2条件下进行有限时间段的生物量积累直至死亡。

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