1株降解玉米秸秆放线菌的筛选

宋德强 张雯婕 张玲 许婷 葛文雪 朱静 王兆慧

摘要[目的]筛选出能够降解玉米秸秆的微生物。[方法]以植物园土层下5 cm取得的腐殖质土壤为样品进行富集培养，通过刚果红染色法进行初步筛选，滤纸崩解法进行二次筛选；以玉米秸秆粉为唯一碳源，经25 ℃、180 r/min摇床培养72 h，测定纤维素酶活性；通过形态观察对菌株进行初步鉴定。[结果]筛选出1株纤维素酶活性最大的菌株WZ16，滤纸酶活性为620 U，CMC酶活性为72 U，通过形态观察初步鉴定WZ16为链霉菌属放线菌。[结论]最终筛选得到1株有较高纤维素酶活性的链霉菌属放线菌，为综合利用玉米秸秆作为生物质能源提供了参考。

关键词 秸秆；纤维素水解；筛选；鉴定

中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）09-016-03

Abstract[Objective]To screen a strain of actinomycetes that can degrade corn stalk cellulose.[Method]Enrichment culture was carried out with 5 cm humus subsurface soil at botanical garden as the sample. Preliminary screening was carried out by Congo red staining. Secondary screening was conducted by paper disintegration method. With corn stalk powder as the only carbon source， shake cultivation was carried out at 25 ℃ under 180 r/min for 72 h. Cellulase activity was detected. Strains were preliminarily identified by morphological observation.[Result]A strain WZ16 with maximum cellulase activity was obtained. Filter paper enzyme activity was 620 U， CMC enzymes activity was 72 U. Morphologic observation showed that WZ16 was streptomyces actinomycetes.[Conclusion]A streptomyces actinomycetes with relatively high cellulase activity is finally obtained， which provides references for the comprehensive utilization of corn stalk as biomass energy.

Key words Straw； Cellulolysis； Screening； Identification

我國秸秆年产量达5.7×108 t，占世界秸秆总产量的20%～30%，是生物质能源的重要组成部分[1-2]。如何充分利用这些资源，国外已有详细研究[3]。但这种宝贵的资源在国内尚未得到充分利用，大部分废弃秸秆被就地焚烧，不仅造成严重的环境污染，威胁人类健康，还会引起火灾，威胁飞机起降，影响车辆安全行驶。因此，国家有关部门做了大量工作，加大研究各种秸秆综合利用技术。目前，国内外秸秆综合利用主要有5个方面：秸秆肥料化利用；通过物理、化学及生物等方式将作物秸秆转化为优质畜牧饲料；秸秆沼气、固化成型等将秸秆开发为能源物质；以秸秆为原料的加工业利用；秸秆基料的应用[4-8]。其中，以秸秆还田、用作饲料和燃烧为主[9-10]。笔者筛选了能够降解玉米秸秆的微生物，并对其所产生的酶活性进行了测定，以期为综合利用玉米秸秆作为生物质能源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品。

腐殖质土壤：南通大学植物园玉米地下5 cm的土壤。

玉米秸秆来自南通大学植物园。

1.1.2 培养基。

秸秆粉：2 mol/L NaOH 浸泡玉米秸秆12 h，蒸馏水洗至中性，干燥箱80 ℃过夜，粉碎后200目过筛[11]。

赫奇逊氏无机盐培养基：KH2PO4 1.00 g，NaCl 0.10 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，NaNO3 2.50 g，FeCl3 0.01 g，CaCl2 0.10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2左右[11]。

种子培养基（PDA）：马铃薯20000 g煮汁纱布过滤去残渣，蔗糖20.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH自然，固体培养基加18.00 g琼脂粉[12]。

CMCNa培养基：羧甲基纤维素钠（CMCNa）10.00 g，马铃薯20000 g煮汁纱布过滤去残渣，琼脂粉18.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH自然[11]。

发酵培养基：赫奇逊氏无机盐培养基 1 000 mL，秸秆粉20.00 g[11]。

高氏I号培养基：可溶性淀粉20.00 g，KNO3 1.00 g，NaCl 0.50 g，K2HPO4 0.50 g，MgSO4 0.50 g，FeSO4 0.01 g，琼脂20.00 g，水 1 000 mL，pH 7.2～74[12]。

1.1.3 试剂。

0.1%刚果红，3，5二硝基水杨酸（DNS）显色试剂，柠檬酸缓冲液[13]，1 mg/mL 葡萄糖标准液。

1.2 方法

1.2.1 富集培养。

1.2.1.1 富集。

将取得的样品土壤和玉米秸稈混合，置于20 ℃左右培养，定时向土壤撒水以保持土壤的湿润。培养7 d左右，观察秸秆是否长出菌斑或菌丝，若无则继续培养直至长出菌斑或菌丝。

1.2.1.2 分离培养。

取出长有菌斑或菌丝的秸秆，连同秸秆上附着的土壤一起放入装有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡30 min后静置得到菌悬液。用无菌水稀释，取1×10-3、1×10-4、1×10-5 这3个稀释梯度溶液各0.2 mL，分别涂布于PDA平板，每个浓度设3个平行，28 ℃培养5～7 d。

观察各个平板，挑出形态不同的菌株，用PDA平板分离纯化得到单菌落并命名，斜面保种。

1.2.2 初筛。

将纯化得到的单菌落分别接种于CMC平板上，28 ℃培养3～5 d。将刚果红染料倒入平板中，为了便于观察，可在染色前将霉菌菌丝刮去。 染色30 min后弃染液，用1 mol/L NaCl脱色1 h。弃去NaCl后观察菌落透明圈大小，挑出具有明显透明圈的菌落，测量菌落直径（d）和透明圈直径（D），计算透明圈直径与菌落直径的比值（D/d）。

1.2.3 复筛。

在装有50 mL赫奇逊氏无机盐培养液的三角瓶中放入1 cm×5 cm的无菌滤纸，分别接入筛选得到的菌株（放线菌和霉菌孢子1×106个/mL、酵母菌1×109个/mL），25 ℃、180 r/min摇床培养。每天观察记录滤纸崩解的情况，无变化记为（-），滤纸边缘模糊记为（+），滤纸弯曲记为（++），滤纸变成碎片记为（+++），滤纸整体崩解，变成纸浆记为（++++）[11]。

1.2.4 发酵培养。

挑选出滤纸崩解较严重的菌株，以放线菌和霉菌1×106个/mL、酵母1×109个/mL接入发酵培养基（每250 mL锥形瓶接入100 mL），25 ℃、180 r/min摇床培养72 h。

1.2.5 酶活性测定。

1.2.5.1 制备粗酶液。

从发酵培养基中取样用2层纱布过滤，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，所得上清液为粗酶液。

1.2.5.2 测定酶活性。

①葡萄糖标准曲线的绘制：

取6支试管，编号，分别加入葡萄糖标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，蒸馏水1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mL，向6支试管分别加入DNS试剂2.0 mL，沸水浴加热5 min，冷却后定容至120 mL，在540 nm波长下测定吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线[13]。

②滤纸酶活（FPase）的测定：

参见刘爽的方法[11]。③内切酶活力（CMCase）的测定：

参见刘爽的方法[11]。

设定每小时1 mL酶液催化1 μg的葡萄糖为1个酶活单位。

1.2.6 菌株的初步鉴定。

分别用插片培养法接种菌株孢子于高氏I号培养基中，培养5～7 d。用镊子取出盖玻片，轻轻擦去外侧下部沾有的培养基，将其带有菌丝的面向下，轻放于载玻片中央，在显微镜下观察自然生长的菌株形态特征，及其基内菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的结构和颜色。根据菌株的菌落特征、菌丝及孢子显微摄影图片对菌株进行初步鉴定。

2 结果与分析

2.1 富集培养结果

共得到16种不同形态的菌株，分别命名为WZ1～WZ16。

2.2 初筛结果

用刚果红染液对16种菌株进行染色，挑出具有明显透明圈的菌落，测量菌落直径（d）和透明圈直径（D），计算透明圈直径与菌落直径的比值（D/d）。由表1可知，透明圈较大的4株菌透明圈直径与菌落直径的比值（D/d）由大到小依次为WZ14、WZ12、WZ16、WZ15。

2.3 复筛结果

由表2可知，WZ15号菌株在初筛中D/d值最小，复筛中滤纸崩解情况最差，5 d滤纸条才碎裂成大块，与另外3种菌株差距较大，WZ15被淘汰，而WZ12、WZ14、WZ16号菌株在复筛中结果相似，继续进行后续的发酵试验。

2.4 粗酶活性测定结果

2.4.1 葡萄糖标准曲线。

由图1可知，葡萄糖的标准曲线是y=1.276 9x，R2为0.999 1，符合数据统计的标准。

2.4.2 纤维素酶活性测定结果。

由图2可知，各菌株滤纸酶活性大小顺序是WZ16、WZ12、WZ14，CMC酶活性大小顺序是WZ14、WZ12、WZ16。而初筛时该3株菌透明圈大小顺序是WZ14、WZ12、WZ16。

滤纸酶活性测定法不但可排除外切β1，4葡聚糖苷酶的干扰，而且可测定到具有真正纤维素分解能力的 Cx（内切β1，4葡聚糖酶）[14]。因此，以滤纸酶活性作为主要筛选标准，另外2种酶活性只作为参考。选出滤纸酶活性最大的菌株WZ16作为后续试验的菌株，并对其进行菌种初步鉴定。

2.5 菌株初步鉴定结果

观察菌株WZ16在固体平板上的形态特征，菌落较小、干燥、不透明，与培养基连接紧密，接种针不易挑取，表面有干粉状孢子（图3）。显微镜下观察菌丝分为基质菌丝、气生菌丝及孢子丝，孢子丝螺旋状排列（图4），参照《放线菌鉴定手册》，初步鉴定菌株WZ16为一株链霉菌属放线菌。

3 结论与讨论

试验最终筛选得到1株有较高纤维素酶活性的链霉菌属放线菌菌株WZ16，但比较其初筛与复筛结果发现不完全一致，主要是由于刚果红染色和滤纸崩解都是定性试验，只能找出具有降解纤维素能力的菌株，无法准确地定量计算试验菌株降解纤维素的能力。只有测定试验菌的纤维素酶活才能确定其降解能力的大小。在试验中，经计算WZ16的酶活最大，经72 h培养后，滤纸酶活为620 U，CMC酶活为72 U，与灰略红链霉菌 C5相比[15]，滤纸酶活高出12.7%，CMC酶活低91.8%，由此可见，WZ16滤纸酶活较高，但CMC酶活很低，这很可能影响降解秸秆的速度。对此，可采用复合菌系[16]，将几种降解秸秆纤维素的菌株混合培养，利用它们对纤维素不同的降解能力产生不同种类的纤维素酶，做到快速高效降解秸秆。

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