多棘海盘车酶解多肽体外抗氧化活性研究

李敏晶　王旭莹　张宇　刘远

摘要[目的]探讨多棘海盘车多肽的抗氧化活性。[方法]对多棘海盘车中水溶性蛋白进行提取，再采用酶解法，以胰蛋白酶和木瓜蛋白酶分别酶解水溶性蛋白，经离心、透析、冻干后分别得到多肽样品TP、PP。通过分析TP、PP对羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O-2·）、1，1二苯基2三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除能力及在脂质体系中的抗氧化能力来表征其体外抗氧化活性。[结果]TP、PP对3种自由基均具有一定的清除作用，对脂质体系的氧化也有一定的抑制作用；PP的抗氧化活性优于TP；TP、PP的抗氧化活性均弱于水溶性蛋白。[结论]研究可为多棘海盘车多肽的深入研究及开发利用提供理论依据。

关键词 多棘海盘车；多肽；抗氧化活性

中图分类号 S912 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）05-113-03

Abstract[Objective]To discuss the antioxidant activity in vitro of the enzymolysis peptide from Asterias amurensis.[Method]Watersoluble protein was extracted from A. amurensis， and then was enzymolyzed by trypsin and papain using enzyme hydrolysis method. After centrifugation， dialysis and freeze drying， peptide samples TP and PP were obtained. Antioxidant activity in vitro was characterized based on analyzing the scavenging activities of TP and PP to hydroxyl radical （·OH）， superoxide anion free radical （O-2·）， and 1， 1 diphenyl 2 trinitrobenzene hydrazine free radicals （DPPH·）.[Result]TP and PP had certain scavenging action to the three free radicals， and had certain inhibitory effects on the oxidation of lipid system.[Conclusion]Antioxidant activity of PP is superior to that of TP； antioxidant activities of TP and PP were poorer to that of watersoluble protein.

Key words Asterias amurensis； Polypeptide； Antioxidant activity

多棘海盘车是我国黄海沿岸一种十分常见的海星，它属于海洋无脊椎动物，棘皮动物门、海星纲、钳棘目、海盘车科。多棘海盘车体呈五星型，口面平坦为浅黄色，反口面较隆起，表面附有较多棘刺，为紫红色，是我国北方海域海星的主要品种[1]。近几十年来，国外的科研人员在各种不同种类的海星中获取了多种活性成分，如：皂苷、甾醇、多糖、蛋白质及氨基酸等，因其具有多种生理及药理活性使得国内也有越来越多的科研人员关注到这一领域[2-4]。已有研究证明，很多从天然产物中获得的多肽具有抗氧化活性[5-7]，但是多棘海盘车酶解多肽抗氧化活性的研究少见报道。笔者探讨了多棘海盘车酶解多肽的抗氧化活性，以期为多棘海盘车多肽的进一步研究及应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料及主要试剂。 多棘海盘车，采自辽宁省大连市黄海海域；木瓜蛋白酶（BR，200 000 U/g）；胰蛋白酶（BR，800～2 500 U/mg）；1，1二苯基2三硝基苯肼（DPPH）、VC、邻苯三酚、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、双氧水、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、亚油酸、硫氰酸铵、无水乙醇、超纯水等试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器。

紫外-可见分光光度计（OPTIZEN 2620UV型）；恒温水浴锅（SY24型）；离心机（LDZ4型）；真空冷冻干燥机（SIM FD5型）；恒温培养箱（SPX250GB型）；电热鼓风干燥箱（101G1B型）；磁力搅拌器（FW100型）；pH计（PB10型）；旋转蒸发仪（RE52CS型）；电子天平（AL204型）；万能粉碎机（FW100型）；纯水制备系统（MilliQ型）。

1.2 方法

1.2.1 酶解多肽的制备。

将多棘海盘车样品于烘箱中60 ℃恒温烘干，在粉碎后过40目筛，备用。

1.2.1.1 水溶性蛋白的制备。采用1∶10 g/mL的固液比用蒸馏水作为溶剂提取多棘海盘车样品，提取液经浓缩、透析、离心、冷冻干燥，得到水溶性蛋白样品，0～4 ℃冷藏备用。

1.2.1.2

TP的制备。采用1∶15 g/mL的固液比用蒸馏水作为溶剂溶解水溶性蛋白样品，加入9%的胰蛋白酶，调节溶液pH 6.0，50 ℃酶解6 h后100 ℃灭活，冷却、离心、冷冻干燥，得到多肽样品TP，0～4 ℃冷藏备用。

1.2.1.3 PP的制备。采用1∶15 g/mL的固液比用蒸馏水作为溶剂溶解水溶性蛋白样品，加入9%的木瓜蛋白酶，调节溶液pH 5.5，70 ℃酶解4 h后100 ℃灭活，冷却、离心、冷冻干燥，得到多肽样品PP，0～4 ℃冷藏备用。

1.2.2 对自由基的清除作用的测定。

对1，1苯基2三硝基苯肼自由基（DPPH·）、超氧阴离子自由基（O-2·）、羟基自由基（·OH）清除能力的测定参照文献[8]的方法进行。

1.2.3 脂质抗氧化活性的测定。

对多肽的脂质抗氧化活性测定采用FTC[ 9-10]法。

2 结果与分析

2.1 对DPPH·的清除作用

由图1可知，TP、PP对DPPH·都有较好的清除作用，随着这2种多肽质量浓度的增加，其清除作用也逐渐增强。在浓度较低时，2种多肽的抗氧化活性较为接近，当浓度大于1.0 mg/mL 后，PP对DPPH·的清除率在相同浓度下显著高于TP。通过清除率曲线可以看出，TP的浓度和清除率之间的关系呈明显的线性关系。2种多肽对比可知，由木瓜蛋白酶酶解所得的多肽抗氧化活性可能优于胰蛋白酶酶解所得多肽。

2.2 对O-2·的清除作用

TP、PP对O-2·的清除作用如图2所示，2种多肽对O-2·的清除活性并不显著，整体趋势仍有随多肽质量浓度的增大而增大的情况，但是在相同浓度下PP对O-2·的清除率略高于TP。该结果进一步证明了不同酶水解所得的多棘海盘车多肽其抗氧化活性也存在差异，PP的抗氧化活性优于TP。

2.3 对·OH的清除作用

由图3可知，在试验浓度条件下，TP、PP对·OH的清除作用效果并不显著。清除率随样品浓度的增大而增大，在相同浓度下PP对·OH的清除率略高于TP，该结果与TP、PP对DPPH·和O-2·的清除作用结论相同。

2.4 脂质抗氧化作用

如图4所示，TP、PP对亚油酸乳化体系的抗氧化效果比较显著，且随着样品浓度的增加，抑制能力也在增加；当浓度达到0.8 mg/mL时，PP的脂质体系抗氧化能力有显著的提升，当浓度大于0.8 mg/mL时，其抗氧化能力增长缓慢，趋于平衡，整体抑制能力较强并显著高于TP。TP的脂质抗氧化活性随浓度的增加而逐渐增大，基本呈线性增长关系。

2.5 多肽与蛋白抗氧化活性比较

在同一浓度（0.4 mg/mL）时，水溶性蛋白、TP、PP的抗氧化活性试验结果如图5所示。从图5可以看出，水溶性蛋白对于3种自由基的清除作用显著高于酶解多肽，特别是对于·OH的清除效果十分显著，已超过90%。该结果说明，对于水溶液中的自由基清除活性，水溶性蛋白要比酶解多肽更加显著。但是，在脂质体系中，水溶性蛋白的抗氧化能力表现稍差。分析其原因：水溶性蛋白是水提成分且分子量较大，不溶于脂质体系，因此在脂质体系中不能更好地分散在溶液中从而不能有效表达其抗氧化活性所致，而多肽由于分子量较小，相对溶解度要高于水溶性蛋白，因此脂质抗氧化活性优于蛋白本身。

3 结论与讨论

该研究表明，采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解制备的多棘海盘车多肽，对DPPH·、O-2·和·OH均具有一定的清除作用，对脂质体系的氧化也有一定的抑制作用。根据清除率计算结果可知，TP、PP对DPPH·清除作用和脂质氧化的抑制作用较为显著，而对O-2·和·OH的清除作用并不显著。多肽样品的浓度越高，其对自由基清除的效果和对脂质氧化的抑制作用越好，其中由木瓜蛋白酶酶解得到的多肽抗氧化活性要优于胰蛋白酶酶解所得多肽；相同浓度下，多棘海盘车水溶性蛋白的清除自由基的能力显著高于酶解多肽，最高可相差9倍。与前人研究结果相比，由胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解多棘海盘车所得多肽对3种自由基的清除率及其脂质体系的抗氧化活性均低于海参、海藻等海洋生物酶解多肽[11-12]。但是对多棘海盘车酶解多肽的抗氧化活性的研究目前鲜见报道，且海星一般属于废弃资源，通过该研究能够获得具有活性的组分，可为海星资源的进一步开发利用提供参考。

参考文献

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