芹菜素对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用

王玉明，杨正涛，张乃生

(吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062)



芹菜素对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用

王玉明，杨正涛，张乃生*

(吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062)

[目的] 揭示芹菜素的抗炎作用机制。[方法] 通过建立小鼠模型，研究芹菜素对LPS诱导急性肺损伤的保护作用。[结果] 芹菜素可以降低LPS诱导的肺组织损伤和肺组织MPO活性。与LPS组相比，芹菜素治疗组可以显著降低肺泡盥洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平，并抑制NF-κB信号通路的激活。[结论] 芹菜素可以通过抑制NF-κB的激活并降低炎性细胞因子的水平，从而对小鼠急性肺损伤产生抗炎保护作用。

LPS；急性肺损伤；芹菜素；NF-κB

急性肺损伤常伴有毛细血管内皮细胞损伤、肺水肿及中性粒细胞浸润等病理学变化[1]。LPS是引起急性肺损伤的主要因素[2]。LPS能够诱导细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6显著升高[3-4]，这些细胞因子可以启动、放大并延续炎症反应，并对机体造成严重损伤。急性肺损伤及其严重时发生的急性呼吸窘迫综合征所导致的病人死亡率约为20%～50%[5-6]。因此，寻找防治急性肺损伤的有效策略具有重要的临床意义。芹菜素是一种黄酮类化合物，研究发现芹菜素具有抗肿瘤、抗炎等多种药理作用[7-8]。据报道，芹菜素可以抑制LPS刺激巨噬细胞所引起的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放[9]，对大鼠急性脑损伤和大鼠肝脏局部缺血再灌注损伤具有一定的保护作用[10]。然而，芹菜素对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用鲜有报道。笔者通过建立小鼠模型观察芹菜素对LPS诱导急性肺损伤的保护作用，并初步揭示芹菜素的抗炎作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

48只清洁级BALB/c小鼠(6～8周龄，体重20～23 g)，购自吉林大学白求恩医学院动物实验中心。小鼠饲养4～6 d以适应新环境，小鼠饲养在相对湿度为40%～80%、温度(24±1)℃、专用动物标准饲料的环境下，饲料和饮水充足，给予12 h循环光照。

1.2 主要试剂

芹菜素购自陕西惠科植物开发有限公司；LPS购自美国Sigma公司；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒均购自美国 Biolegend公司；组织蛋白提取试剂盒及BCA蛋白浓度试剂盒均购自美国Thermo公司；NF-κB p65和IκB抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 试验分组与给药

将48只小鼠随机分为4组，分别为空白组、LPS组、芹菜素(20.0 mg/kg体重)+LPS组、地塞米松+LPS组。芹菜素+LPS组按照20 mg/kg体重腹腔注射给药，地塞米松+LPS组按照5.0 mg/kg体重腹腔注射地塞米松，空白组和LPS组分别注射相同体积的PBS，1 h后采用乙醚吸入麻醉小鼠。LPS组、芹菜素+LPS组和地塞米松+LPS组小鼠鼻孔滴入500 μl/kg 的LPS，空白组鼻孔滴入50 μl PBS。

1.4 肺组织MPO检测

LPS处理后7 h将小鼠处死，然后取出肺脏组织(右肺)，称取100 mg放入研钵中研磨，PBS溶解后收集上清，使用MPO试剂盒检测肺组织活性。

1.5 肺组织病理组织学检查

LPS处理后7 h将小鼠处死，取左肺放入 10%甲醛中固定，石蜡切片，HE染色后观察肺脏病理学变化。

1.6 BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6检测

LPS处理后7 h将小鼠处死，分离气管，然后将气管套管插入到小鼠气管中，用1.3 ml 的PBS盥洗并采集，回收肺泡灌洗液于离心管中，3 000 r/min离心10 min。使用ELISA试剂盒检测BALF中炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.7 Western Blot 检测肺组织NF-κB激活

取肺组织经行蛋白提取，然后BCA蛋白定量，用10%的SDS-PAGE胶分离，电泳结束后进行转膜，孵育一抗(1∶1 000)，PBST再洗3次。然后孵育二抗，PBST再洗3次，应用Supersignal West Pico化学底物进行显影，拍照保存。

1.8 数据统计与分析

所有试验结果均以平均值±标准差表示，利用方差分析和Student’s t-test来分析任意2组数据间的差异。其中，P<0.01和P<0.05分别表示差异极显著和差异显著。

2 结果与分析

2.1 芹菜素对LPS诱导ALI小鼠肺组织病理学变化的影响

与空白对照组相比，LPS组肺脏组织破坏严重，肺泡壁增厚，出现大量炎性细胞浸润，而芹菜素(20 mg/kg)治疗组和地塞米松组肺脏组织学变化都有所缓解(图1)。

2.2 芹菜素对LPS诱导ALI小鼠肺组织MPO活性的影响

从图2可以看出，与空白对照组相比，LPS组MPO活性显著升高(P<0.05)，芹菜素(20 mg/kg)治疗组和地塞米松组肺组织MPO活性与LPS组相比显著降低(P<0.01)。

2.3 芹菜素对LPS诱导ALI小鼠BALF中炎性细胞因子的影响

从图3可以看出，与空白对照组相比，LPS组TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子显著升高(P<0.05)，而芹菜素(20 mg/kg)治疗组和地塞米松组3种炎性细胞因子的含量显著低于LPS组(P<0.01)。

2.4 芹菜素对NF-κB信号转导通路的影响

从图4可以看出，与空白对照组相比，LPS刺激显著提高NF-κB p65和IκB的磷酸化水平(P<0.05)，激活NF-κB信号转导通路。与LPS处理组相比，芹菜素治疗组能够明显降低LPS导致的NF-κB p65和IκB的磷酸化水平的升高(P<0.01)，抑制NF-κB信号转导通路激活。

3 讨论与结论

急性肺损伤是一种常见的急危重症，死亡率很高，严重威胁重症患者的生命安全[11]。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，是造成肺损伤的主要毒力因子。目前，LPS造成机体炎症反应的信号通路被逐步阐明，通过炎症信号通路来治疗肺损伤为该病的防治提供了新思路。芹菜素属于黄酮类化合物，具有抗癌和抗炎等多种药理活性。笔者研究了芹菜素对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用。该试验结果表明芹菜素对LPS诱导的小鼠急性肺损伤具有一定的保护作用。

MPO活性是嗜中性粒细胞渗入组织的一种标志，LPS诱导的肺损伤常伴有肺脏中性粒细胞浸润，呈现出增高的MPO活性[12]。该研究发现芹菜素可以抑制肺组织MPO活性，同时肺脏组织切片结果表明芹菜素可以减少肺组织炎性细胞浸润。这表明芹菜素对LPS诱导急性肺损伤小鼠具有保护作用。

LPS刺激机体会引起大量的炎性细胞因子产生。在许多的炎性细胞因子中，研究发现TNF-α、IL-1β和IL-6在肺损伤的发病过程中发挥了重要作用[13]。这些炎性细胞因子交织成网，互相影响，从而调控肺损伤的发生和转归。笔者通过ELISA检测芹菜素对LPS诱导的小鼠肺组织炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的影响。结果表明芹菜素可以显著抑制LPS引起的3种炎性细胞因子的表达。NF-κB是一个重要的核转录因子，研究发现其参与炎症反应及炎性细胞因子基因的调控，在机体防御和抵抗炎症反应的过程发挥极为重要的作用[14]。研究发现，LPS刺激机体，会引起NF-κB的激活，进而引起炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的产生。因此，研究芹菜素对LPS诱导NF-κB激活的影响，结果表明，芹菜素可以显著抑制LPS诱导的NF-κB的激活，从而抑制3种炎性细胞因子的表达，减轻LPS造成的肺组织损伤。综上所述，芹菜素通过抑制NF-κB信号转导通路的激活，抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，对LPS诱导的小鼠肺损伤具有保护作用。

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The Protective Effects of Apigenin on LPS-induced Acute Lung Injury in Mice

WANG Yu-ming, YANG Zheng-tao, ZHANG Nai-sheng*

(College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun, Jilin 130062)

[Objective] To reveal the anti-inflammation mechanism of apigenin. [Method] The protective effects of apigenin on LPS-induced acute lung injury were studied by establishing mice model. [Result] Apigenin could decrease the injury of lung tissues induced by LPS and MPO activity of lung tissues. Compared with LPS group, the expression levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β in BALF were significantly decreased and the activation of NF-κB signal pathway was inhibited in apigenin group. [Conclusion] Apigenin can inhibit LPS-induced ALI in mice by inhibiting the activation of NF-κB signaling pathway and reducing the levels of inflammatory cytokines.

LPS; Acute lung injury; Apigenin; NF-κB

王玉明(1973- )，男，甘肃酒泉人，讲师，硕士，从事兽医内科学方面的研究。*通讯作者，教授，硕士，博士生导师，从事兽医内科学方面的研究。

2015-11-19

S 865.1

A

0517-6611(2015)35-187-03