γ-L-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸对肝星状细胞线粒体功能的影响

张笔觅，孙瑞波，吕智超，杨明静，李万良*

(1.吉林省经济管理干部学院，吉林长春 130012；2.吉林省农业科学院，吉林长春 130033)



γ-L-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸对肝星状细胞线粒体功能的影响

张笔觅1，孙瑞波1，吕智超1，杨明静2，李万良2*

(1.吉林省经济管理干部学院，吉林长春 130012；2.吉林省农业科学院，吉林长春 130033)

[目的]通过研究γ-L-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸(GSAC)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)线粒体功能的影响，探讨GSAC对肝纤维化的抑制作用。[方法]利用微板法测定GSAC对培养24 h细胞线粒体代谢甲基噻唑基四唑(MTT)的影响，以罗丹明123作为染料，通过流式细胞仪检测线粒体膜电位。[结果]GSAC具有抑制HSC-T6线粒体代谢MTT的作用，IC50值为0.835 mg/ml；GSAC引起线粒体膜电位崩溃，所有GSAC处理组(0.2、0.4与0.8 mg/ml)罗丹明123荧光强度极显著高于对照组。[结论]GSAC可破坏HSC-T6细胞线粒体功能，提示其对肝纤维化具有抑制作用。

γ-L-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸；肝星状细胞；线粒体膜电位；MTT

肝纤维化是一类严重危害我国人民健康的疾病，若肝纤维化未及时治疗可转变成肝硬化，导致死亡[1]。肝星状细胞(Hepatic stellate cells，HSC)是肝脏的一种间质细胞，位于肝窦周围的Disse间隙，HSC可通过调节肝脏细胞外间质(Extracellular matrix，ECM)合成与降解，使肝脏保持正常结构[2]。HSC正常时呈静息状态，在肝损伤时，HSC激活转化为肌成纤维细胞，活化的HSC细胞增殖明显，可表达多种细胞因子及其受体，可使ECM分泌增加造成ECM过度沉积，最终导致肝纤维化的形成，因而HSC在肝纤维化形成过程中发挥关键的作用[3]。采用化学物质直接抑制HSC的增殖，减少ECM产生，理论上可以控制肝纤维化疾病的进程。目前已有很多种产品对肝纤维化具有抑制作用[4]，但作用效果均不十分理想，因而有必要继续寻找抑制肝纤维化的有效成分。

大蒜是一种很好的保健食品，具有杀菌、保护心脑血管、解毒等作用。有研究指出大蒜对四氯化碳和乙醇所致的急、慢性肝损伤以及高脂饮食引起的肝脏慢性损伤、可卡因引起的急性肝损伤等均具有较好的保护作用[5]。目前对大蒜保肝功能成分的研究多集中在含硫的挥发性成分，如二烯丙基硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)等[6]，对于非挥发性成分研究很少。大蒜中可分离出多种非挥发性二肽化合物，如γ-L-谷氨酰-S-烯丙基半胱氨酸(γ-L-glutamoyl-S-allyl-L-cysteine，GSAC)、γ-L-谷氨酰甲基半胱氨酸(GSMC)以及γ-L-谷氨酰丙烯基半胱氨酸(GSPC)[7]，其中GSAC是最主要的一种[8]。GSAC是一种非挥发性化学物质，没有大蒜的强烈刺激气味，且水溶性好，易于加工，可见该化合物与挥发性成分比较具有一定优势，有必要对其功能进行深入研究，但目前相关报道很少。该试验拟研究GSAC对体外培养HSC-T6细胞线粒体功能的影响，探讨GSAC对肝纤维化的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肝星状细胞株HSC-T6，从北京鼎国昌盛生物技术公司购买，其表型为活化的HSC，可表达高水平的I型胶原，该实验室自行复苏，培养，传代；GSAC，该实验室从大蒜中提取分离，经高效液相检测纯度为95.8%；MTT(Genview公司，BRD)；DMEM(Hyclone公司，USA)；胎牛血清(Hyclone公司，USA)；胰蛋白酶(Sigma公司，USA)；罗丹明123(碧云天生物技术研究所)。

1.2 仪器与设备

CO2培养箱(Thermo，USA)；荧光显微镜(Nikon-TS100，日本)；倒置显微镜(Motic AE2000，中国)；流式细胞仪及CellQuest分析软件(BD Biosciences，USA)。

1.3 方法

1.3.1 HSC-T6细胞培养。HSC-T6 细胞接种于无菌培养瓶中，加入适量含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素、1%链霉素的DMEM高糖培养液，在5% CO2、37 ℃饱和湿度的培养箱中培养，待细胞融合至80%时进行传代，传代时用2 ml 0.25%胰酶消化至细胞间隙变宽，部分细胞于瓶底脱落，加入2 ml血清终止消化，以1 000 r/min离心10 min，弃上清液，以培养基洗涤3次后接种于新培养瓶中。

1.3.2 半数抑制浓度IC50值测定。采用噻唑蓝(MTT)比色法检测，在Natarajan等[9-10]方法的基础上进行改进。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至106/ml，接种于96孔板中，每孔加入200 μl 5% CO2，37 ℃培养，至细胞单层铺满96孔微板底，加入质量浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/ml的GSAC。另以细胞培养液为空白对照，每个浓度设3个平行孔。继续孵育24 h，倒置显微镜下观察细胞形态；每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5% MTT)继续孵育4 h;弃培养液，加入200 μl DMSO，振荡15 min，酶联免疫检测仪波长490 nm处测量各孔的吸光值，求出IC50值。

1.3.3 线粒体膜电位检测。

1.3.3.1 荧光显微镜观察细胞形态。依据罗丹明123 染色观察方法[11]，为保证细胞数量选定小于IC50值处理浓度进行处理。试验分为空白对照组、0.2 mg/ml GSAC、0.4 mg/ml GSAC与0.8 mg/ml GSAC共4组。将细胞接种于24孔板中，并加入不同质量浓度GSAC，每个浓度设3个平行孔，孵育24 h后，加入PBS缓冲液稀释后的罗丹明 123(5 mg/L)、5% CO2，37 ℃培养箱中孵育30 min。PBS缓冲液洗涤3次后荧光显微镜观察细胞形态。

1.3.3.2 流式细胞术检测线粒体膜电位。依据罗丹明123流式细胞术操作方法[12]，将细胞接种于6孔板中，分为空白对照组、0.2 mg/ml GSAC、0.4 mg/ml GSAC、0.8 mg/ml GSAC处理组(分别约相当于1/4、1/2 与1倍IC50值)。每组设3个平行孔，孵育24 h，经0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min收集细胞，各组加入Rhodamine 123 荧光指示剂用以标记活细胞，指示剂终浓度为5 mg/L，于37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次，重悬细胞，流式细胞仪检测细胞内Rhodamine 123 荧光强度(fluorescence intensity，FI)，显示线粒体膜电位(△ψm)变化(激发波长488 nm，发射波长525 nm)。经CellQuest软件进行收取和数据分析。

1.3.4 数据处理。每项数据均为3次重复试验的结果，试验数据经SPSS16.0 统计软件进行one-way ANOVA方差分

析，多组数据比较用 Least Significant Difference(LSD)test 检测，P<0.05认为具有显著差异。

2 结果与分析

2.1IC50值测定

图1表明，GSAC处理浓度低于0.2 mg/ml时，对HSC-T6细胞MTT代谢活力无明显影响，且各组抑制率无显著差异，不具有统计学意义；随着GSAC浓度的提高，对HSC-T6细胞抑制率逐渐增加。质量浓度为0.2 mg/ml时，对HSC-T6细胞抑制率为10.5%；质量浓度为3.2 mg/ml时，对细胞抑制率达85.6%。经SPSS 16.0统计软件计算，IC50值为0.835 mg/ml，95%可信区间为0.470～1.161 mg/ml。

2.2 GSAC对HSC-T6细胞形态学的影响

分组培养24 h后，倒置显微镜下观察HSC-T6 细胞形态，结果发现(图2)，空白对照组HSC-T6 细胞无明显形态改变，细胞呈星形，星芒状突起丰富，高倍镜下细胞核呈圆形或不规则形，核仁圆形，清晰可见，整体仍呈肌成纤维细胞样细胞(myofibroblast-like cell，MFB)外形，未见到核染色质浓集；GSAC处理组较对照组细胞减少，细胞间隙增宽，随GSAC浓度增大，上述改变越明显；0.2和0.4 mg/ml GSAC处理组细胞膜保持完整，可见少部分细胞于瓶底脱落，悬浮于上清液中；0.8、1.6和3.2 mg/ml GSAC处理组可见细胞悬浮、皱缩、坏死、崩解。

2.3 线粒体膜电位检测

由荧光显微镜观察结果(图3)可见，对照组细胞Rhodamine123荧光强度减弱或消失，0.2 mg/ml GSAC处理组中可见个别线粒体受损细胞，0.4与0.8 mg/ml GSAC处理组荧光强度增强。

由流式细胞术检测线粒体膜电位结果(图4)可见，0.2、0.4、0.8 mg/ml GSAC处理组较对照组荧光强度增强，差异显著具有统计学意义(P<0.01)，随GSAC处理浓度增加，荧光强度依次增强。说明GSAC可导致细胞线粒体膜通透性改变，促进细胞线粒体损伤，且随浓度增加作用明显。

3 讨论与结论

线粒体是生物所需能量的生产场所，在大多数组织细胞中，线粒体的ATP生成量约占细胞的90%，作为细胞内主要的ATP生产中心，线粒体在人体衰老、细胞程序性死亡以及信号传导过程中起非常重要的作用[13]。线粒体功能障碍导致线粒体外膜通透性增大，引起间隙蛋白(如细胞色素C等)的释放，最终引发细胞凋亡[14]。因此，通过检测线粒体功能，可以初步判定GSAC对HSC-T6细胞的影响与机制。噻唑蓝为一种黄色、水溶性的物质，在线粒体脱氢酶催化下可以代谢转化成蓝色的水不溶性甲臜，由于该反应速度与细胞存活或线粒体呼吸功能成正比，因而MTT法可用于定量分析存活细胞数量或线粒体功能[15]。该试验中GSAC抑制了MTT代谢，表明其对肝星状细胞具有毒性作用。

线粒体膜两侧质子及其他离子的不对称分布形成了线粒体膜电位(△ψm)，△ψm下降是细胞凋亡特异性指标之一[16]。Rhodamine123是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，可作为线粒体膜电位指示剂。在正常细胞中可依赖△ψm进入线粒体基质中，使其荧光强度减弱，而凋亡细胞由于线粒体膜完整性被破坏，线粒体膜通透性运转孔开放，引起△ψm崩溃，Rhodamine123重新从线粒体释放于细胞基质中，导致荧光强度增强[14]。该研究中，GSAC导致荧光强度增强，说明产生了破坏线粒体膜电位作用。△ψm测定结果进一步证实GSAC通过破坏线粒体膜电位，发挥对肝星状细胞的毒性作用。

Ma等[16]研究表明大蒜对化学性肝损伤具有保护作用，通过二甲基亚硝胺(DMN)建立大鼠肝纤维化模型验证了大蒜对肝细胞具有保护作用，并认为大蒜可能是通过抑制星状细胞转化成肌纤维细胞，从而拮抗肝纤维化的发生。且大蒜能明显降低试验性肝纤维化大鼠的血清丙氨酸转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平，表明大蒜对DMN所致肝纤维化具有保护作用[17]。该研究结果表明，GSAC是大蒜抑制肝纤维化的一种活性成分，GSAC在体外能够抑制肝星状细胞增殖，可破坏肝星状细胞线粒体功能，引起线粒体跨膜电位下降，表明其对肝形状细胞具有抑制作用，提示GSAC可能对防止肝纤维化的形成具有积极作用。有关GSAC如何抑制线粒体功能的深层次作用机制尚不明确。国内外多项研究证明一些大蒜中的有机硫化物对肿瘤细胞线粒体功能具有抑制作用，并对其作用机制进行了深层次探究[18-20]。该研究中GSAC可能通过类似的作用机制抑制HSC-T6细胞线粒体功能，具体机理尚待进一步研究。

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Effect of γ-L-glutamoyl-S-allyl-L-cysteine on Mitochondrial Function of Hepatic Stellate Cells

ZHANG Bi-mi1, SUN Rui-bo1, LV Zhi-chao1,LI Wan-liang2*et al

(1.Jilin Province Economic Management Cadre College, Changchun,Jilin 130012; 2.Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun,Jilin 130033)

[Objective] The research aimed to explore inhibition effect of γ-L-glutamoyl-S-allyl-L-cysteine (GSAC) on liver fibrosis by studying the influence of GSAC on the mitochondrial function of rat hepatic stellate cells (HSC-T6).[Method]After 24 h culture in different concentrations of GSAC, methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) metabolism was tested, with the median inhibitory concentration (IC50) value obtained in a microplate assay, and mitochondrial membrane potential (MMP) was tested in a flow cytometer assay with Rhodamine 123 as indicator.[Result]GSAC inhibited MTT metabolism, withIC50=0.835 mg/ml, and GSAC inhibited MMP, the fluorescence intensity in GSAC treated groups (0.2, 0.4 and 0.8 mg/ml) significantly increased compared to the control. [Conclusion] GSAC damages mitochondrial function of HSC-T6 cells, which suggests that GSAC has an inhibitory effect on liver fibrosis.

γ-L-glutamoyl-S-allyl-L-cysteine; HSC-T6 cells; Mitochondrial membrane potential; MTT

张笔觅(1989-)，女，吉林长春人，助教，硕士，从事食品科学研究。*通讯作者，研究员，硕士，从事科技期刊编辑工作。

2015-11-16

S 633.4

A

0517-6611(2015)35-220-03