嗜高温灰树花工厂化生产菌株的筛选研究

冯芳侠，付庆伟，王凤春，付庆成

(1.迁西县农牧局，河北迁西 064300；2.迁西县板栗产业研究发展中心，河北迁西 064300；3.迁西县虹泉食用菌专业合作社，河北迁西 064300)



嗜高温灰树花工厂化生产菌株的筛选研究

冯芳侠1，2，付庆伟2，3，王凤春2，付庆成3

(1.迁西县农牧局，河北迁西 064300；2.迁西县板栗产业研究发展中心，河北迁西 064300；3.迁西县虹泉食用菌专业合作社，河北迁西 064300)

[目的]筛选适合相对高温环境生产出菇的菌种。[方法]通过比较11个野生灰树花菌株的菌丝生长速率、生长势、拮抗性，并以栽培周期、子实体品质及前期生物学转化率等为指标进行工厂化栽培考察。[结果]菌株“ZDSJ-08”在24～32 ℃生长温度层架式栽培方式下，71 d 2次出菇累计基质生物转化率为88.6%；同时在颜色、风味、叶片厚度、口感及朵形等方面表现优秀。[结论]菌株“ZDSJ-08”适合灰树花高温工厂化栽培。

灰树花；高温；菌株筛选；工厂化

灰树花[Grifolafrrondosa(Dicks.Fr.)S.F.Gray]是珍贵的药食两用菌。人工栽培的历史较短，受前期生物转化率低、多糖含量低等因素制约，灰树花栽培成本较高，工厂化生产技术发展缓慢，制约了整个行业的发展。筛选前期生物转化率高、适合高温环境出菇的工厂化栽培菌种，能够满足夏季及初秋温度较高环境下工厂化出菇，又能降低生产成本，可以极大地满足灰树花工厂化栽培的需求[1]。笔者通过比较11个野生灰树花菌株的菌丝生长速率、生长势、拮抗性，并以栽培周期、子实体品质及前期生物学转化率等为指标进行工厂化栽培考察，筛选出适合相对高温环境生产出菇的菌种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 培养基配方。

1.1.1.1 基础培养基。马铃薯200 g、栗木屑50 g、麦麸50 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、维生素B1 0.01 g、CaH2PO43 g、MgSO41.5 g、琼脂粉20 g，定容至1 000 ml。

1.1.1.2 原种、栽培种培养基。栗木屑35%、棉籽皮15%、麸皮15%、玉米芯20%、栗蓬10%、海泡石粉2%、蔗糖1%、过磷酸钙1%、石膏1%，含水量65%，常压100 ℃灭菌12 h，即可。

1.1.2 供试菌种及来源。从唐山市迁西县东荒峪、汉儿庄等地收集25个野生菌株，采用组织分离法，取子实体柄叶结合部位组织接种到基础培养基平板上，在25 ℃下恒温培养形成菌落，采用菌丝尖端纯化法纯化菌种，并用基础培养基斜面保存备用，经过分离、纯化、初筛获得11个优种，依次编号为“ZDSJ-01”～“ZDSJ-11”。以当地主栽品种‘小黑汀’为对照，河北省燕山科学试验站提供。

1.1.3 试剂。木聚糖(Sigma公司)；其他试剂如醋酸钠、酒石酸钾钠、丙酮、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、MgSO4、NaOH等均为国产分析纯试剂。

1.1.4 主要仪器。UV8100紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；梅特勒电子分析天平，河南郑州南北仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 最适生长温度的试验。采用生长速率法进行测定。用基础培养基做成平板，接种环挑菌种置于平板中央，分别在18、20、22、24、26、28、30、32 ℃条件下，恒温培养10 d后，测量菌落直径，每个处理做3个平行试验。

1.2.2 出菇试验。以栗木屑35%、棉籽皮15%、玉米芯20%、麸皮15%、栗蓬10%、海泡石粉2%、蔗糖1%、过磷酸钙1%、石膏1%为配方。将栗木屑、棉籽壳、栗蓬渣等主料称好、混匀，再将麸皮、过磷酸钙、蔗糖、石膏等辅料随水拌入料中，料水比为1∶1.2～1∶1.3，含水量65%，常压100 ℃灭菌12 h，即可。以主栽品种“小黑汀”为对照， 与11个野生优种各200棒做对比试验；采用层架式发菌，菌丝长满菌袋后，剥袋置于生长畦(长×宽×深=2 m×0.5 m×0.3 m)内，覆土栽培，出菇两潮为止。分别记录2次出菇量、出菇温度、出菇时间、平均单重、转化率、产量、颜色、气味、叶片厚度、产量等指标[2-3]。

1.2.3 菌丝生长势的测定。以主栽品种“小黑汀”为对照，将ZDSJ-01、ZDSJ-04和ZDSJ-08等3个野生优种在基础培养基活化后，沿菌落的边缘取直径5 mm的菌块，分别接种于PDA加富平板培养基上。每个菌种做3个重复，于各自适宜的生长温度下恒温培养3 d，每天定时观察菌落的生长状况，并精确测量菌落半径，计算菌丝生长速度。菌丝生长速度(mm/d)=菌落半径(mm)/菌丝生长天数(d)。

1.2.4 木聚糖酶活力测定。沿菌落边缘挖取模拟出菇培养基上的菌丝各1 g于试管中，加pH 4.6、0.1 mol/L醋酸钠缓冲液10 ml，25 ℃浸提过夜(12 h)，将浸提液用滤纸过滤，取滤液1 ml加入试管中，然后加入9 ml的蒸馏水稀释，充分混匀，得粗酶液待用。将pH 4.6醋酸钠缓冲溶液、1%木聚糖溶液及粗酶液于40 ℃水浴预热2 min，然后在试管中依次加入pH 4.6醋酸钠缓冲溶液1 ml、1%木聚糖溶液0.5 ml、稀释后的粗酶液0.5 ml，40 ℃水浴30 min后，加入DNS 3 ml，100 ℃水浴5 min后水冷，波长510 nm下测OD值。酶活力以样品与底物反应30 min后吸光值的改变表示。

2 结果与分析

2.1 最适生长温度的试验结果

菌落直径结果显示(表1)，一般灰树花菌株菌丝体生长适宜温度为22～30 ℃，在22 ℃以下或30 ℃ 以上生长缓慢，生长最适温度为26～28 ℃；ZDSJ-01、04、08在相对高温具有较大的生长量，其中ZDSJ-08能够在相对较高(29 ℃)的温度下达到很高的生长量，有较大的应用空间。

表1 不同温度下测量的菌落直径 mm

2.2 出菇试验结果

由表2可见，传统优种“小黑汀”比ZDSJ-08号优种2次出菇总时间长12 d，且后者在较高温度(29 ℃)生物转化率达88.6%以上；ZDSJ-04号优种也比“小黑汀”早5 d完成出菇，生物转化率同比高6.3%。结合灰树花子实体的特有香气、灰黑色、叶片厚实等传统评价指标，筛选优种ZDSJ-08具有耐高温(29 ℃)、前期生物转化率高(88.6%)及较好的产品特性，符合工厂化生产菌种的特征。

2.3 菌丝生长势的测定结果

从表3可看出，4个灰树花菌株在PDA加富培养基上的生长速度虽存在一定的差异，但不明显，生长速度排列顺序为ZDSJ-08>ZDSJ-04>小黑汀> ZDSJ-01；ZDSJ-04和ZDSJ-08灰树花优种生长势较旺，有粗壮优势菌丝发育。

表3 PDA加富的菌丝生长势

2.4 木聚糖酶活力测定结果

与“小黑汀”菌种对比，ZDSJ-01、ZDSJ-04和ZDSJ-08这3个筛选的灰树花菌株的木聚糖酶活力差异明显，分别为23.96、19.66和23.33 U，均高于对照组(13.12 U)；其中ZDSJ-01菌株的活力最高，超出“小黑汀”85%，ZDSJ-08次之。

3 结论与讨论

该试验通过最适生长温度和小试工厂化生产，只能提供灰树花优种的筛选依据，不能完全依靠其结果作为菌株筛选的最终标准。该试验阶段获得ZDSJ-01、ZDSJ-04和ZDSJ-08共3个野生优种，均能在≥27 ℃时正常出菇；其中ZDSJ-08号可以在29 ℃时71 d完成2次出菇，且生物转化率达88.6%；同时子实体性状和产品标准较高，是难得的工厂化生产菌种。继续考察了3个野生优种的生长势、木聚糖酶活力和拮抗性，以定性或半定量的形式考察了菌种的亲缘性关系和生物转化能力,其中ZDSJ-08虽不是每项指标均最佳，但综合评比最佳。

综上所述，灰树花菌株ZDSJ-08可以作为夏季或较高温地区工厂化生产菌种，能在71 d内完成2次出菇，总生物转化率达88.6%，与传统主栽品种“小黑汀”相比，优势非常明显；同时菌株生物稳定性好，可进一步研究其栽培工艺、环境控制参数等条件，保证高产、稳产。

[1] 潘辉,王瑞娟,李正鹏，等.工厂化栽培灰树花菌株的筛选研究[J].北方园艺, 2011(1):188-191.

[2] 沈高潮,姚庭永,姚松涛,等.灰树花“小黑汀”的特性及栽培要点[J].食药用菌,2014,22(1):59-60.

[3] 陈秀娟.灰树花工厂化周年栽培技术[J].中国园艺文摘,2012(6):141-142.

Study on Screening Resistance ofGrifolafrondosaProduction Strains at High Temperature

FENG Fang-xia1,2，FU Qing-wei2,3，WANG Feng-chun2et al

(1.Qianxi County Agriculture and Animal Husbandry Bureau,Qianxi,Hebei 064300;2.Qianxi Chestnut Industry Research Development Centre,Qianxi,Hebei 064300;3.Qianxi County Hong Quan Mushroom Cooperatives,Qianxi,Hebei 064300)

[Objective] The research aimed to select the suitable relatively high temperature environment to produce mushroom strains. [Method]Through the comparison of mycelium growth rate, growth vigor, antagonism of 11 wild strains ofGrifolafrondosa,and with cultivation period, fruitbody quality and early biological conversion rate as indicators,the industrial cultivation were studied.[Result]Under 24-32 ℃temperature battery cultivation mode,the mushroom cumulative biological matrix conversion rate of strain “ZDLM-08” was 88.6% for 71 days and two times.At the same time in color, flavor, leaf thickness, taste , fine flower shape and so excellent.[Conclusion]Strain “ZDLM-08” was suitable for high temperature factory cultivation ofGrifolafrondosa.

Grifolafrondosa; High temperature;Strains screening;Factory

冯芳侠(1982-)，女，陕西宝鸡人，农艺师，硕士，从事微生物发酵及食用菌研究。

2015-11-06

S 646

A

0517-6611(2015)35-223-02