一株具有抗菌活性有丝真菌092902的鉴定

张志华

(忻州职业技术学院医学系，山西忻州 034000)



一株具有抗菌活性有丝真菌092902的鉴定

张志华

(忻州职业技术学院医学系，山西忻州 034000)

[目的] 对一株具有抗菌活性的有丝真菌092902进行鉴定。[方法] 采用典型形态特征、 生理生化碳源同化及ITS序列3种鉴定方法。[结果] 从形态方面，菌株092902与标准菌株黑曲霉As3.40菌落形态和显微形态观察极为相似，初步判断菌株092902属于黑曲霉；从Biolog微生物鉴定仪碳源同化方面，鉴定结果是黑曲霉；从菌株ITS序列进一步确认菌株092902与NCBI数据库中黑曲霉相似率达到100%。[结论]从这3个方面共同对菌株092902作出鉴定，该菌属于黑曲霉。

形态特征；Biolog生理特征；ITS序列；鉴定；黑曲霉

红树林生长于热带亚热带海岸潮间带，属于近海水域，红树林地区充分降解的有机物、浮游生物、频繁的潮汐、强风及强紫外线、大量栖息鸟类、特定温度及盐度、缺氧污泥环境为红树林真菌多样化形成提供了有利条件。红树林真菌丰富多样，已报道的产生活性物质红树林真菌主要类群有青霉属、曲霉属、拟茎点霉属、拟盘多毛孢属、镰孢菌属、拟青霉属等[1]。笔者以真菌经典形态特征为主要依据，结合其生理生化特征、ITS序列对菌株092902进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 菌种

菌株092902从海南文昌头苑红树林区海桑叶分离得到，具有较强抗白色念珠菌活性，标准菌株黑曲霉As 3.40从中国科学院微生物研究所购买，马丁斜面保存菌种。

1.2 形态观察

采用三点培养法观察菌落形态，采用查氏培养基培养，在4～16 d不同时间段观察菌落特征，以颜色、质地、表面文饰、生长速度等指标为主要观察点。

采用载片培养法观察菌株092902的显微形态，在湿室培养环境下，在不同时间将载片取出，用BH-2多用研究显微镜观察其显微形态，注意其处于无性生殖阶段还是有性生殖阶段，若是有性生殖阶段尤其注意分生孢子梗及分生孢子形态。

1.3 生理生化特性鉴定

菌株092902的生理生化鉴定主要依据Biolog微生物鉴定系统，一方面可以判断出菌株碳源利用情况，另一方面可以找出与其数据库中相似率高的真菌。

1.4 真菌DNA提取

将20 mg菌丝体液氮研碎，加入SDS提取液400 μl，13 000 r/min离心4 min，然后取上清液300 μl，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液，离心3 min，再取上清液加入200 μl氯仿∶异戊醇混合液(24∶1)，离心1 min，取新管装上清液，加入400 μl 2 mol/L NaCl和无水乙醇，离心8 min，去除上清，加入缓冲液100 μl，65 ℃温浴1 h，电泳检测。

1.5 PCR扩增及序列测定

PCR扩增采用引物18SR(BMB-‘C’)：5′- CGA CGG GCG GTG TGT AC-3′和18SF(SR1R)：5′-AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT-3′[2-3]。

反应体系为50 μl，含10×Buffer PCR缓冲液5 μl，0.2 μmol/L 引物1.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 6 μl，5 U/μlTaqDNA聚合酶0.5 μl，1 μl模板，36 μl水。扩增程序：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 形态特征

菌株092902在查氏培养基上，菌落起初为白色，后转为褐色，不呈绿色，8～10 d直径可达2.0～3.8 cm。分生孢子梗自基质生出，长短不一，一般为5～6 mm，直径11～17 μm，光滑；顶囊黑色球形，梗基一般50～60 μm×10～20 μm，小梗25～35 μm×10～20 μm；分生孢子头黑色球形，一般800～1 000 μm；分生孢子4～5 μm，成熟后有脊状突起或纵向条纹。从菌落形态和显微形态观察，菌株092902与标准菌株黑曲霉As3.40极为相似，都有菌丝，一开始呈白色，双层小梗自顶囊着生，分生孢子头黑色球形，分生孢子球形，初步判断菌株092902属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛梗孢科曲霉属黑曲霉(Aspergillusniger)。

2.2 生理生化特征

菌株092902可以同化杨梅苷、赤藻糖醇、琥珀酸[4]。Biolog微生物自动鉴定系统根据真菌显色反应和浊度，与标准菌株数据库进行比对，鉴定结果为Aspergillusniger，这与菌株092902的形态特征初步鉴定结果一致，Biolog微生物自动鉴定系统与形态特征一致，判断菌株092902属于黑曲霉。

2.3 18S rDNA分析

菌株092902的ITS序列在GeneBank中以登录号DQ401554登记，结合图1，0929025Aspergillusniger相似率达到100%，结合形态特征及生理生化特征，经核酸序列验证菌株092902是黑曲霉。

3 结论与讨论

传统的真菌分类鉴定主要依据经典形态特征，随着近年来分子生物学技术的大力发展，核酸序列分析结合经典形态特征的方法对真菌的鉴定得到越来越广泛的应用。该研究分别从形态、生理生化、分子技术3方面来鉴定菌株092902，从形态方面观察，菌株092902与标准菌株黑曲霉菌落形态和显微形态观察较为接近，初步判断菌株092902属于黑曲霉；从Biolog微生物鉴定仪碳源同化方面，鉴定菌株是黑曲霉；最后，从菌株ITS序列进一步确认菌株092902与NCBI数据库中黑曲霉相似率达到100%。从上述3个方面共同对菌株092902给出了一致归属，提高了鉴定的可信性和准确性。

近年来，关于红树林真菌次级代谢产物化学成分及生物活性的研究很多，但对菌种的鉴定较少，对菌种完整准确的鉴定更少，一部分人主要依赖经典形态特征对真菌进行鉴定，一部分人单纯依靠Biolog微生物鉴定系统给出鉴定结果，而另一部分人则直接依赖核酸序列在数据库的比对情况直接鉴定真菌[5]。从3个方面或更多方面结合起来去鉴定真菌的相对较少，该研究是在真菌鉴定方法方面的积极尝试。

[1] 杨加庚，梅益勤，裴月湖，等.海洋真菌次级代谢产物化学成分及生物活性的研究进展[J].沈阳药科大学学报，2013，30(1)：72-82.

[2] HYDE K D.A comparison of the intertidal mycota of five mangrove tree species[J].Asian Mar Biol，1990，7：93-107.

[3] JONES E B G，ALIAS S A.Biodiversity of mangrove fungi[M]//Biodiversity of tropical microfungi.Hong Kong：Hong Kong University Press，1997：71-92.

[4] 中国科学院微生物研究所.常见及常用真菌[M].北京：科学出版社，1978.

[5] 邓祖军，曹理想，周世宁.红树林内生真菌的分离及代谢产物生物活性的初步研究[J].中山大学学报(自然科学版)，2010，49(2)：100-104.

Identification of the Antifungal Active Strain 092902

ZHANG Zhi-hua

(Department of Medicine,Xinzhou Vocational Technical College,Xinzhou,Shanxi 034000)

[Objective] The aim was to study identification of the antifungal active strain 092902. [Method]Identification of the strain 092902 was done using three methods: morphological identification, biolog physiological tests and ITS sequence.[Result] Firstly, strain 092902 was compared withAspergillusnigerAs3.40, the morphological characteristics of them were very similar, strain 092902 wasAspergillusniger. Secondly, according to Biolog microorganism identification system, strain 092902 was identified asAspergillusniger. Finally, ITS sequence and GeneBank blast affirmed that the similarity rate was 100%. [Conclusion]The morphological identification, physiological tests and ITS sequence confirm that the strain 092902 wasAspergillusniger.

Morphological characterization; Biolog physiological characterization; ITS sequence;Identification;Aspergillusniger

张志华(1980- )，女，山西五台人，讲师，硕士，从事医学微生物免疫学课程教学及相关科研工作。

2015-11-13

S 718.81

A

0517-6611(2015)35-229-02