不同激素对西洋参胚性愈伤组织诱导的影响

蒋 超，蒋景龙，沈季雪，伍娜娜，张 庆，徐卫平，田 雲

(陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中 723001)



不同激素对西洋参胚性愈伤组织诱导的影响

蒋 超，蒋景龙*，沈季雪，伍娜娜，张 庆，徐卫平，田 雲

(陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中 723001)

[目的] 建立高效的西洋参胚性愈伤组织诱导体系。[方法] 以裂口的西洋参种子为试材，研究不同激素对西洋参种胚脱分化启动与愈伤组织诱导的影响，并分析其体胚发生过程。[结果] 不同激素对西洋参胚性愈伤组织诱导效果存在明显差异，当培养条件为MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L时，愈伤组织诱导率最高为96.4%；在解剖显微镜下观察，西洋参体胚发生过程中球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚清晰可见。[结论]该研究为西洋参快繁体系的建立和优化奠定一定的理论基础。

西洋参；愈伤组织；培养条件；体细胞胚

西洋参(PanaxquiquefoliumL.)为五加科人参属多年生草本植物，是一种比人参温和的名贵药材，我国自20世纪80年代成功大面积引种以来，已发展成为世界第三大西洋参生产国和第一大消费国，目前已形成东北、华北和西北三大主产区[1]。西洋参以根入药，主要含有40多种皂苷、多糖和氨基酸等有效成分，具有增强机体免疫力、保护心血管系统和治疗糖尿病肥胖病等功效，在医疗和保健上应用广泛，市场需求量日益增长[2]。西洋参生长周期长，且易受气候、地域、环境栽培条件以及病虫害影响和栽培连作障碍等问题，利用西洋参愈伤组织细胞培养生产有效次级代谢产物已有相关报道[3-5]，但由于西洋参愈伤组织的特性和品质差异，往往产量较低，很难满足实际需求。根据西洋参种胚形成愈伤组织率高且品质好的特点[6]，笔者选取汉中留坝成熟种胚为试材，研究不同条件对西洋参种胚脱分化启动与愈伤组织诱导的影响，并分析其体胚发生过程，为提升西洋参愈伤组织诱导率及诱导速度、建立一套西洋参高效再生体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

西洋参种子采购于汉中留坝县西洋参标准化示范区，经过1年的沙藏层积、低温处理，裂口率为85%以上，选择裂口成熟种子(图1A)的种胚(图1B)为外植体。

1.2 方法

1.2.1 外植体的预处理。挑选沙土中保藏的饱满、圆润并出现裂口的西洋参种子，去掉外种皮，并用流水冲洗1～2 h，洗净，备用。取上述种子用75%的乙醇浸泡20 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%的升汞浸泡8 min，并用无菌蒸馏水漂洗4～5次。将消毒后的种子剥离，取其种胚接种于MS+激素的三角瓶中，每瓶接4～5个外植体，培养温度(25±2)℃，相对湿度50%～70%，暗培养30 d。

1.2.2 诱导条件的筛选。以MS为基本培养基，内含30 g/L的蔗糖和6 g/L的琼脂，附加不同种类和浓度的激素(表1)。定期统计膨大率和出愈率，并计算相应的二级变量。膨大率=M/K×100%，膨大速度=(Mx-My)×[(X-Y)×K]；出愈率=N/K×100%，出愈速度=(Nx-Ny)×[(X-Y)×K]，其中M表示外植体膨大数，Mx表示第X天膨大的外植体数，My表示第Y天膨大的外植体数，N表示外植体膨大数，Nx表示第X天外植体愈伤数，Ny表示第Y天外植体愈伤数，K表示接种外植体总数。

1.2.3 胚状体的鉴别。培养30 d后，选择浅黄色、生长旺盛、新鲜湿润的愈伤组织接种到含1.0 mg/L 2，4-D的继代培养基上，继代3次，继代周期为20 d，45 d后将疏松愈伤组织在解剖显微镜下进行解离，观察体细胞胚所处时期。

1.3 数据分析

采用SPSS13.0和Excel 2003进行数据分析，探索不同培养条件下不同培养方式对西洋参愈伤组织和胚状体诱导效应的影响。

2 结果与分析

2.1 西洋参胚性愈伤组织诱导过程

将西洋参种胚接种到不同激素搭配的培养基后，外植体的膨大数、膨大速度、出愈数和出愈速度等差异较大(表2)。

表1 西洋参愈伤组织诱导试验设计 mg/L

表2 不同组合方式下西洋参种胚膨大数和出愈数 个

西洋参种胚接种到含2，4-D的MS培养基上，3 d后M2和M7中外植体开始萌动，并出现明显可见的膨大，7 d后各组合外植体均出现明显膨大(图2A)，14 d左右膨大的胚轴和子叶边缘有白色突起(图2B)，膨大部位逐渐形成愈伤组织，其中，M6和M7中形成愈伤组织最多，少数外植体直接形成愈伤组织，多数情况下种胚的一端或两端同时膨大，表面呈紫色色素的积累，随着时间的延长，色素逐渐退去。培养30 d后，整片子叶及胚轴基部都出现黄色颗粒状愈伤组织，称为分生小球体(图2C)。分生小球体随着培养时间的延长而逐渐增大到直径0.5～2.5 mm的大颗粒，愈伤组织逐渐增多，生长旺盛(图2D)。培养20 d后，愈伤组织生长旺盛，质地疏松，生长量高(图2E)，继代3次后，愈伤组织状态良好，生长旺盛，质地疏松，色泽为鹅黄色，愈伤组织的大小和色泽出现明显区别(表3)。培养45 d后，继代培养基上愈伤组织有胚状体发生，胚状体多成簇状发生，基部黏连现象严重(图2F)。

表3 不同继代次数对西洋参愈伤组织诱导的影响

注：愈伤组织按大小分成4级，分别记为++++，+++，++，+；-表示无褐化。

2.2 不同组合方式对西洋参种胚膨大的效应

膨大在一定程度上反映了外植体细胞进行脱分化的潜能[7]。以不同激素搭配的培养条件为自变量，分别以膨大率和膨大速度为因变量作单因素方差分析。结果表明，不同激素搭配对西洋参种胚膨大的效应显著(F=3.241，P<0.05)，即在不同激素的搭配下，西洋参种胚膨大率存在明显差异。从各个处理的效果对比分析，M2外植体膨大效果最好，膨大率均为92.9%(图3)。不同激素的搭配对西洋参种胚膨大速度也表现极强的显著性(F=5.098，P<0.01)，其中M6的膨大速度相对最快，为0.082个/d(图4)。从总体上看，除M2外，西洋参种胚膨大效应中的膨大率和膨大速度并未表现出较好的一致性。M8的膨大率达到很高水平，但膨大速度却处于较低水平；相反，M6的膨大率虽未表现出明显优势，但膨大速度却达到较高水平。

2.3 不同组合方式对西洋参种胚出愈率的影响

出愈率是从静态上衡量外植体诱导愈伤组织效果的一项重要指标，它能确定愈伤组织发生的最佳条件；而出愈速度则是从动态变化的角度衡量外植体愈伤形成与积累的快慢程度。以不同激素搭配的培养条件为自变量，以出愈率和出愈速度为因变量作一维方差分析。

结果表明，不同激素搭配对西洋参种胚出愈率和出愈速度的效应极显著(F=4.691，P<0.01；F=16.245，P<0.01)。由图5、6可知，除M4和M9外，其他激素组合培养下西洋参种胚的出愈率均在70%以上，由此可见，西洋参种胚脱分化相对容易，是诱导愈伤组织的良好外植体来源。从动态变化看，出愈速度与出愈率之间虽有一定的一致性，但表现并不明显。M5～M8出愈率相对持平，但出愈速度却急剧变化，其中M6的出愈速度表现极低的水平(0.004个/d)。

2.4 胚性愈伤组织的鉴定

取继代2～3次的愈伤组织，挑选一部分鲜嫩、疏松的愈伤组织在解剖镜下解离观察，发现胚性愈伤组织表面具致密的球形颗粒，颜色乳白色或黄色，呈半透明状，质地较坚实，继续剥离疏松愈伤组织，解离出球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚(图7)。

3 结论与讨论

该研究表明，以西洋参成熟种胚为外植体，诱导愈伤组织的最佳组合是MS+6% g/L琼脂+30 g/L的蔗糖+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L，诱导率为96.4%；在解剖显微镜下，西洋参胚性愈伤组织的特征非常明显，发生过程清晰可见，依次经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚等过程。

该试验选择西洋参种胚为外植体诱导愈伤组织，诱导效果显著，诱导率最高为96.4%，而张成国等[8]以西洋参花药诱导愈伤组织，诱导率最高为37.53%。王逸群等[9]以西洋参根为外植体诱导愈伤组织，诱导率最高为75.51%。在激素组合方面，张成国等[8]和王逸群等[9]选择诱导愈伤组织的最佳组合方式均为2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，但诱导率均低于该研究结果。该研究首次对西洋参胚性愈伤组织所处时期进行鉴定，分析其体胚发生过程，结果发现，西洋参种胚诱导胚性愈伤组织，胚状体簇状发生率较高，但发育时期不同步，这些问题将在以后的研究中继续探索。该研究为西洋参愈伤组织的诱导和体胚发生过程，以及通过胚性愈伤组织建立西洋参再生体系奠定基础。

[1] 周海燕，赵润怀，傅建国，等.国产西洋参生产及商品规格质量的调查分析[J].中国现代中药，2013，15(4)：324-328.

[2] 宋娟，雷秀娟，尹红新，等.五加科药用植物悬浮培养技术研究进展[J].

特产研究，2014，36(1)：67-73.

[3] KOCHAN E，CHMIEL A.Dynamics of ginsenoside biosynthesis in suspension culture ofPanaxquinquefolium[J].Acta physiologiae plantarum，2011，33(3)：911-915.

[4] 汤飞宇，王华磊，郭玉海.西洋参离体快速繁殖和次生代谢物生产研究进展[J].江西农业大学学报，2005，27(5)：787-791.

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[6] 胡选萍，曹小勇，秦公伟，等.西洋参不同外植体诱导愈伤组织研究[J].江苏农业科学，2012，40(3)：48-50.

[7] 张美萍，王义，魏汉莲，等.西洋参脱分化基质优化及影响因素[J].吉林农业大学学报，2003，25(4)：378-381.

[8] 张成国，王英平，姚春林，等.西洋参花药愈伤组织诱导培养条件的优化[J].特产研究，2013(1)：41-45.

[9] 王逸群，周志华.西洋参愈伤组织及愈伤组织中人参皂苷Rg1和Rb1含量分析[J].漳州师范学院学报，2005，18(4)：62-66.

The Effect of Different Hormones on The Induction of Embryogenic Callus inPanaxginsengL.

JIANG Chao，JIANG Jing-long*，SHEN Ji-xue et al

(College of Bioscience & Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong , Shaanxi 723001)

[Objective] To establish a high-efficiency embryogenic callus induction ofPanaxginsengL.. [Method] Taking the seeds ofPanaxginsengL. with openings as test material,the effect of different culture conditions on the callus induction from embryonic axis explants ofPanaxginsengL. was studied, and the process of somatic embryogenesis were analyzed. [Result] The result showed significant differences by studying influence of inducement for callus in different hormones. Orthogonal experiment indicated that the culture conditions: MS + 2,4-D 0.5 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L + IBA 0.5 mg/L had extremely significant callus effect, the induction rate up to 96.4%. ThePanaxginsengL. somatic embryogenesis could be observed clearly, which experienced globular embryo heart-shaped embryo, torpedo-shaped embryo and cotyledon embryo under a dissecting microscope. [Conclusion] The study provide some theoretical basis for the establishment and optimization of rapid propagation system.

PanaxquiquefoliumL.; Callus; Culture condition; Somatic embryo

陕西省科技厅基金项目(2015KTTSSF01-02)；陕西理工学院研究生创新基金项目(SLGYCX1517)。

蒋超(1988- )，男，四川资阳人，硕士研究生，研究方向：西洋参无性快速繁殖研究。*通讯作者，讲师，博士，硕士生导师，从事植物细胞工程研究。

2015-11-09

S 567

A

0517-6611(2015)35-234-04